Een Choroid Plexus Epitheliale-Cell gebaseerde model van het menselijk bloed-cerebrospinale vloeistof Barrier om bacteriële infectie studie uit het basolaterale Side
Summary
The epithelial cells of the choroid plexus (CP) form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). An in vitro model of the BCSFB employs human choroid plexus papilloma (HIBCPP) cells. This article describes culturing and basolateral infection of HIBCPP cells using a cell culture filter insert system.
Abstract
The epithelial cells of the choroid plexus (CP), located in the ventricular system of the brain, form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). The BCSFB functions in separating the cerebrospinal fluid (CSF) from the blood and restricting the molecular exchange to a minimum extent. An in vitro model of the BCSFB is based on cells derived from a human choroid plexus papilloma (HIBCPP). HIBCPP cells display typical barrier functions including formation of tight junctions (TJs), development of a transepithelial electrical resistance (TEER), as well as minor permeabilities for macromolecules. There are several pathogens that can enter the central nervous system (CNS) via the BCSFB and subsequently cause severe disease like meningitis. One of these pathogens is Neisseria meningitidis (N. meningitidis), a human-specific bacterium. Employing the HIBCPP cells in an inverted cell culture filter insert system enables to study interactions of pathogens with cells of the BCSFB from the basolateral cell side, which is relevant in vivo. In this article, we describe seeding and culturing of HIBCPP cells on cell culture inserts. Further, infection of the cells with N. meningitidis along with analysis of invaded and adhered bacteria via double immunofluorescence is demonstrated. As the cells of the CP are also involved in other diseases, including neurodegenerative disorders like Alzheimer`s disease and Multiple Sclerosis, as well as during the brain metastasis of tumor cells, the model system can also be applied in other fields of research. It provides the potential to decipher molecular mechanisms and to identify novel therapeutic targets.
Introduction
De bloed-cerebrospinale vloeistofbarrière (BCSFB) is een van de drie plaatsen barrière tussen bloed en hersenen 1. De morfologische correlaat zijn de epitheelcellen van de choroid plexus (CP) 2,3, een endotheel-epitheliale convoluut, die sterk gevasculariseerd en in de ventrikels. De CP dient om de cerebrospinale vloeistof (CSF) te produceren en om deze uit het bloed te scheiden. Om de barrière functie te bereiken, de CP epitheliale cellen vertonen een lage pinocytotic activiteit uitdrukken specifieke transporters, en worden dicht verbonden door een continu netwerk van krappe kruispunten (TJs) 2,3.
Menselijke choroid plexus papilloma (HIBCPP) cellen, afgeleid van een kwaadaardige choroid plexus papilloom van een Japanse vrouw 4, werden gebruikt om een functionele in vitro model van de BCSFB construeren. HIBCPP cellen een aantal karakteristieken van een functionele BCSFB de vorming van TJstrengen, de ontwikkeling van een hoge transepitheliale membraanpotentiaal welke bepaald als transepitheliale elektrische weerstand (TEER) en geringe permeabiliteit voor macromoleculen. Bovendien HIBCPP cellen brengen karakteristieke transporters, die kunnen dienen tot de ionische micro-omgeving te reguleren, en tonen apicale / basolaterale polariteit 5,6,7.
De BCSFB is aangetoond gefunctioneerd als ingangsplaats voor ziekteverwekkers (bacteriën, virussen en schimmels) in het centrale zenuwstelsel (CNS) 8. De invasie van ziekteverwekkers, waaronder Neisseria meningitidis (N. meningitidis), een Gram-negatieve bacterie kan ernstige ziekten zoals meningitis veroorzaken. Bewijs dat het overwint de beschermende epitheliale barrière van de CP wordt ondersteund door histopathologische observaties bij patiënten met meningokokken ziekte vertonen verhoogde hoeveelheden van meningokokken in de vaten en CP epitheelcellen 9,10. Om binnenkomst in gastheercellen ba te krijgencteria kapen vaak endocytotische mechanismen, die worden gemedieerd of veroorzaakt door specifieke oppervlakte receptoren op de gastheercellen. Aangezien interacties van pathogenen met deze receptoren kunnen soortspecifiek 11, diermodellen kunnen alleen worden geraadpleegd beperkte mate. De HIBCPP cellijn biedt de mogelijkheid om de invasie proces en de onderliggende moleculaire mechanismen in een humaan model te bestuderen. Gebruikmakend van celkweek inserts stelt ons in staat om interacties van pathogenen analyseren gastheercellen uit twee verschillende cel kanten. Veel bacteriën, inclusief N. meningitidis, sterk de invloed van de zwaartekracht tijdens infectie tests onderworpen. Optimale interactie van pathogenen met HIBCPP cellen tijdens de testen worden de bacteriën eerst toegevoegd aan het bovenste compartiment van de celkweek filterinzetstuk systeem. Om infectie inschakelen van het apicale of basolaterale celkant respectievelijk twee varianten van het in vitro systeem zijn established: In het standaardsysteem HIBCPP cellen worden gezaaid in het bovenste compartiment van het filterelement, het nabootsen van de situatie wanneer micro-organismen op het CB-kant en in contact met de apicale zijde van de cellen (Figuur 1 A, C). In tegenstelling tot het gebruik van de HIBCPP cellen in een omgekeerde celcultuur filter insert systeem weerspiegelt de voorwaarden wanneer bacteriën de bloedbaan hebt ingevoerd. Micro-organismen verspreiden in het bloed en ontmoeting CP epitheelcellen van de basolaterale zijde (Figuur 1B, D). Opmerkelijk in dit modelsysteem is aangetoond dat bacteriën tasten HIBCPP cellen in een polair wijze bepaald uit de basolaterale zijde cel 5,7.
Vervolgens infectie van de CP, kan de invasie ziekteverwekkers worden herkend door het aangeboren immuunsysteem door middel van ligatie aan receptoren patroonherkenning (PRRS). Goed beschreven leden van het PRRS behoren tot de Toll-achtige receptor (TLR) familie. kan TLRs bind karakteristieke structuren van besmettelijke micro-organismen, die genoemd pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) zijn. Ligatie van de receptoren leidt tot activatie gastheercel signaaltransductiecascades dat expressie van cytokines en chemokines 12, die op zijn beurt stimuleert transmigratie van immuuncellen in de BCSFB 13,14 activeren. Het is aangetoond dat HIBCPP cellen brengen verschillende TLRs op mRNA-niveau en dat infectie met N. meningitidis resulteert in afscheiding van verschillende cytokinen en chemokinen, waaronder CXCL1-3, IL6, IL8 en TNFa 15,16.
We beschrijven kweek en infectie van de humane cellijn HIBCPP in omgekeerde celkweek insert systeem dat BCSFB nabootst. Dit modelsysteem toelaat om interacties van pathogenen met de in vivo desbetreffende basolaterale celkant en de daaropvolgende cellulaire respons studie.
Protocol
Representative Results
Discussion
De epitheelcellen van de CP vormen de BCSFB dat de CSF uit het bloed 2,3 scheidt. We hebben onlangs vestigde de HIBCPP cellijn als een functioneel humaan model van de BCSFB. De cellen vertonen belangrijke barrièrefunctie van de BCSFB in vitro, waaronder de ontwikkeling van een hoge membraanpotentiaal, een lage permeabiliteit voor macromoleculen, alsmede de aanwezigheid van continue strengen TJs 5. TJ eiwitten dragen bij aan een apicale / basolaterale polariteit van de cellen. De polaritei…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Prof. Hartwig Wolburg for performing the electron microscopy.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 4´,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| 12-well plates | Starlab | CC7682-7512 | |
| 24-well plates | Starlab | CC7682-7524 | |
| Anti Neisseria meningitidis α-OMP | This antibody was a gift from Drs. H. Claus and U. Vogel (University of Würzburg, Germany) | ||
| Alexa Fluor 488 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21441 | |
| Alexa Fluor 594 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21442 | |
| Alexa Fluor 660 Phalloidin | Invitrogen | A22285 | |
| Bovine serum albumine (BSA) | Calbiochem | 12659 | |
| Chocolate agar plates | Biomerieux | 43109 | |
| Cytochalasin D | Sigma | C8273 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES | Gibco | 31330-095 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES w/o Phenolred | Gibco | 11039-047 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 10270106 | |
| FITC-Inulin | Sigma | F3272 | |
| Insulin | Sigma | 19278 | |
| MgCl2 | Sigma | 2393 | |
| NaHCO3 | Sigma | 55761 | |
| PBS + Mg +Ca | Gibco | 14040-174 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | |
| Polyvitex | Biomerieux | 55651 | |
| Proteose peptone | BD | 211684 | |
| Serum-free medium | Gibco | 10902-096 | |
| Thincert cell culture inserts for 24-well plates, pore size 3 µm | Greiner | 662630 | |
| Tissue culture flask 75 cm² red cap sterile | Greiner | 658175 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 with MERSSTX01 electrode | Millipore | MERSSTX00 |
Referenzen
- Abott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37, 13-25 (2009).
- Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 75-88 (2010).
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin Imunopathol. 31, 497-511 (2009).
- Ishiwata, I., Ishiwata, C., Ishiwata, E., Sato, Y., Kiguchi, K., Tachibana, T., et al. Establishment and characterization of a human malignant choroid plexus papilloma cell line (HIBCPP). Hum Cell. 18, 67-72 (2005).
- Schwerk, C., Papandreou, T., Schuhmann, D., Nickol, L., Borkowski, J., Steinmann, U., et al. Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in anovel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. PloS One. 7, e30069 (2012).
- Bernd, A., Ott, M., Ishikawa, H., Schroten, H., Schwerk, C., Fricker, G. Characterization of efflux transport proteins of the human choroid plecus papilloma cell line HIBCPP, a functional in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Pharm Res. , (2014).
- Gründler, T., Quednau, N., Stump, C., Orian-Rousseau, V., Ishikawa, H., Wolburg, H., et al. The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).
- Schwerk, C., Tenenbaum, T., Kwang, S. K., Schroten, H. The choroid plexus – a multi-role player during infectious diseases of the CNS. Front Cell Neurosci. 9, 80 (2015).
- Pron, B., Taha, M. K., Rambaud, C., Fournet, J. C., Pattey, N., Monnet, J. P., et al. Interaction of Neisseria meningtidis with the components of the blood-brain barrier correlates with increased expression of PilC. J Infect Dis. 176, 1285-1292 (1997).
- Guarner, J., Greer, P. W., Whitney, A., Shieh, W. J., Fischer, M., White, E. H., Carlone, G. M., et al. Pathogenesis and diagnosis of human meningococcal disease using immunohistochemical and PCR assays assays. Am J Clin Pathol. 122, 754-764 (2004).
- Pizarro-Cerda, J., Kuhbacher, A., Cossart, P. Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, (2012).
- Beutler, B. Microbe sensing, positive feedback loops and the pathogenesis of inflammatory diseases. Immunol. Rev. 227, 248-263 (2009).
- Wilson, E. H., Weninger, W., Hunter, C. A. Trafficking of immune cells in the central nervous system. J Clin Invest. 120, 1368-1379 (2010).
- Meeker, R. B., Williams, K., Killebrew, D. A., Hudson, L. C. Cell trafficking through the choroid plexus. Cell Adh Migr. 6, 390-396 (2012).
- Borkowski, J., Li, L., Steinmann, U., Quednau, N., Stump-Guthier, C., Weiss, C., et al. Neisseria meningitidis elicits a pro-inflammatory response involving I kappa B zeta in a human blood-cerebrospinal fluid barrier model. J Neuroinflammation. 11, 163 (2014).
- Steinmann, U., Borkowski, J., Wolburg, H., Schroppel, B., Findeisen, P., Weiss, C., et al. Transmigration of polymorphnuclear neutrophils and monocytes through the human blood-cerebrospinal fluid barrier after bacterial infection in vitro. J Neuroinflammation. 10, 30 (2013).
- McGuiness, B. T., Clarke, I. N., Lambden, P. R., Barlow, A. K., Poolman, J. T., Heckels, J. E. Point mutation in meningococcal por A gene associated with increased endemic disease. Lancet. 337, 514-517 (1991).
- Ram, S., Cox, A. D., Wright, J. C., Vogel, U., Getzlaff, S., Boden, R. Neisserial lipopolysaccharide is a target for complement component C4b. inner core phosphoethanolamine residues define C4b linkage specificity. J Biol Chem. 278, 50853-50862 (2003).
- Claus, H., Maiden, M. C., Maag, R., Frosch, M., Vogel, U. Many carried meningococci lack the genes required for capsule synthesis and transport. Microbiology. 148, 1813-1819 (2002).
- Claus, H., Maiden, M. C., Wilson, D. J., Mccarthy, N. D., Jolley, K. A., Urwin, R., et al. Genetic analysis of meningococci carried by children and young adults. J Infect Dis. 191, 1263-1271 (2005).
- Tenenbaum, T., Papandreou, T., Gellrich, D., Friedrichs, U., Seibt, A., Adam, R., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cell Microbiol. 11, 323-336 (2009).
- Laflamme, N., Echchannaoui, H., Landmann, R., Rivest, S. Cooperation between toll-like receptor 2 and 4 in the brain of mice challenged with cell wall components derived from gram-negative and gram-positive bacteria. Eur J Immunol. 33, 1127-1138 (2003).
- Laflamme, S., Rivest, S. Toll-like receptor 4: the missing link of the cerebral innate immune response triggered by circulating gram-negative bacterial cell wall components. FASEB J. 15, 155-163 (2001).
- Zughaier, S. M. Neisseria meningitidis capsular polysaccharides indice inflammatory responses via TLR2 and TLR4-MD-2. J Leukoc Biol. 89, 469-480 (2011).
- Yamamoto, M., Yamazaki, S., Uematsu, S., Sato, S., Hemmi, M., Hoshino, K., et al. Regulation of Toll/IL-1-receptor -mediated gene expression by the inducible nuclear protein IkappaBzeta. Nature. 430, 218-222 (2004).
- Lorenz, J., Zahlten, J., Pollok, I., Lippmann, J., Scharf, S., N’Guessan, P. D., et al. Legionella pheumophila-induced IkappaBzeta-dependent expression of interleukin-6 in lung epithelium. Eur Respir J. 37, 648-657 (2011).
- Jaerve, A., Muller, H. W. Chemokines in CNS injury and repair. Cell Tissue Res. 349, 229-248 (2012).
- Schneider, H., Weber, C. E., Schoeller, J., Steinmann, U., Borkowski, J., Ishikawa, H., et al. Chemotaxis of T-cells after infection of human choroid plexus papilloma cells with Echovirus 30 in an in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Virus Res. 170, 66-74 (2012).
- Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. Choroid plexus: Target for polypeptides and site of their synthesis. Microsc. Res. Tech. 52, 65-82 (2001).
- Dickson, P. W., Schreiber, G. High levels of messenger RNA for transthyretin (prealbumin) in human choroid plexus. Neurosci. Lett. 66, 311-315 (1986).
- Stylianopoulou, F., Herbert, J., Soares, M. B., Efstratiadis, A. Expression of the insulin-like growth factor II gene in the choroid plexus and the leptomeninges of the adult rat central nervous system. Proc Natl Acad Sci USA. 85, 141-145 (1988).
- Lim, L., Zhou, H., Costa, R. H. The winged helix transcription factor HFH-4 is expressed during choroid plexus epithelial development in the mouse embryo. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94, 3094-3099 (1997).
- Vandenhaute, E., Stump-Guthier, C., Lasierra Losada, M., Tenenbaum, T., Rudolph, H., Ishikawa, H., et al. The choroid plexus may be an underestimated site of tumor invasion to the brain: an in vitro study using neuroblastoma cell lines. Cancer Cell Int. , 15-102 (2015).
