Charakterisierung von humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen durch Imaging Durchflusszytometrie: Ein Vergleich zwischen zwei Monozyt Isolation Protokolle
Summary
This study compares two different methods of human monocyte isolation for obtaining in vitro dendritic cells (DCs). Monocytes are selected by adherence or negatively enriched by magnetic separation. Monocyte yield and viability along with MDDC viability, proliferation and CD11c/CD14 surface marker expression will be compared between both methods.
Abstract
Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and pathogenesis of inflammation. Isolation and study of DCs have been important in biological research because of their distinctive features. Although they are essential key mediators of the immune system, DCs are very rare in blood, accounting for approximately 0.1 – 1% of total blood mononuclear cells. Therefore, alternatives for isolation methods rely on the differentiation of DCs from monocytes isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The utilization of proper isolation techniques that combine simplicity, affordability, high purity, and high yield of cells is imperative to consider. In the current study, two distinct methods for the generation of DCs will be compared. Monocytes were selected by adherence or negatively enriched using magnetic separation procedure followed by differentiation into DCs with IL-4 and GM-CSF. Monocyte and MDDC viability, proliferation, and phenotype were assessed using viability dyes, MTT assay, and CD11c/ CD14 surface marker analysis by imaging flow cytometry. Although the magnetic separation method yielded a significant higher percentage of monocytes with higher proliferative capacity when compared to the adhesion method, the findings have demonstrated the ability of both techniques to simultaneously generate monocytes that are capable of proliferating and differentiating into viable CD11c+ MDDCs after seven days in culture. Both methods yielded > 70% CD11c+ MDDCs. Therefore, our results provide insights that contribute to the development of reliable methods for isolation and characterization of human DCs.
Introduction
Dendritische Zellen (DCs) sind wesentliche Vermittler der angeborenen und adaptiven Immunsystem. Sie funktionieren auf primäre Immunantworten induzieren und die Entwicklung von immunologischen Gedächtnisses erleichtern. Diese Zellen sind in erster Linie verantwortlich für die Antigen – capture, Migration und T – Zell – Stimulation und werden daher als professionelle Antigen präsentierende Zellen bezeichnet (APCs) 1 .Manipulation von DCs in einer Vielzahl von Forschungsfeldern und im klinischen Umfeld verwendet werden könnte , anders zu behandeln Entzündungserkrankungen wie HIV 6,7, Krebs 8, Autoimmunerkrankungen 9 und allergische Reaktionen 10. DCs sind auch für Drogenmissbrauch Forschung eingesetzt, um unbekannte Mechanismen und Wege zu lösen , wie sie im Zusammenhang mit Alkoholabhängigkeit 11-14, Drogenabhängigkeit 13,15, und die Kombination von HIV – Infektionen und Drogenmissbrauch 16-19. Diese laufenden Studien und zukünftige Studien in auf dem Gebiet der Immunologie machen in vitro Generierung von DCs extrem wichtig für die Forschung. Es gibt jedoch einige Schwierigkeiten , die mit DCs aus humanem Blut zu isolieren , da sie nur 0,1 bilden – 1% der gesamten mononuklearen Blutzellen 20.
Bis heute sind einige der gut etablierten Methoden zur Erzeugung von DCs in vitro besteht aus Kunststoff oder Glas , Adhäsion von Monozyten 21,22, Dichtegradientenzentrifugation 23, spezifischer Marker basierend Trennung wie magnetische aktivierte Zellsortierung 22, fluoreszenzaktivierte Zellsortierung 24, positive Selektion von CD14 + Monozyten Dextran-beschichteten magnetischen Nanopartikel 25 verwenden und schnelle Isolierung von hoch gereinigten Monozyten vollautomatisierte negativen Zellselektion 26 verwendet wird . Allerdings bleibt die beste Methode der Wahl umstritten. Daher DC Erzeugungstechniken zu verbessern, wurden verschiedene Verfahren entwickelt worden, in denenDie Reinheit dieser Zellen stark durch Differenzierung aus gereinigtem CD34 + Vorläuferzellen und Monozyten , isoliert aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) 27 erhöht werden kann. Wie vor erwähnt, ist ein weit verbreitetes und beliebte Methode für Monozyten – abgeleiteten dendritischen Zellen (MDDCs) Erzeugen der Fähigkeit der Monozyten zu untersuchen , um Glas oder Kunststoff (Adhärenz – Methode) 21,22,27 haften. Die Einhaltung Methode ist eine schnelle und einfache Methode, die nicht die Verwendung von komplexer Ausrüstung erfordert. Jedoch enthalten einige Nachteile dieses Verfahrens Lymphozyt Kontamination, eine geringe Flexibilität und Monocyten transient Manipulation 28. Ein alternatives Verfahren zur Einhaltung Methode ist die magnetische Isolierung von Monozyten aus Gesamt PBMCs, insbesondere bei Verwendung eines menschlichen Monocyten – Anreicherungs Kit, der 26 Monozyten aus PBMCs durch negative Selektion isoliert ausgebildet ist. Während dieses Verfahrens werden unerwünschte Zellen zur Entfernung mit tetrameren gezielteAntikörper-Komplexe und Dextran-beschichtete magnetische Teilchen. Der Vorteil dieser Isolationsmethode besteht darin, daß die unerwünschten markierten Zellen mit Hilfe eines Magneten getrennt werden, während die Zielzellen frei, ohne dass Spalten aus in ein neues Röhrchen gegossen werden. Bis heute mit der Verfügbarkeit von spezifischen monoklonalen Antikörpern, die spezifisch Zellpopulationen, die magnetische Trenntechnik hat etikettieren kann nicht einfach eine zusätzliche Methode, sondern eine Notwendigkeit für die Isolierung von seltenen Zellen in dem Gebiet der Immunologie werden. Beispielsweise Techniken wie magnetische Zellsortierung mit handelsüblichen paramagnetischem MACS-Nanopartikel haben die Entwicklung neuer Ansätze für Forschung und klinische Anwendungen 22,29 erleichtert. Darüber hinaus haben die jüngsten Studien Forschung Vergleich DC Generation von Monozyten Adhärenz und MACS – Technologie Methoden eine höhere DC – Reinheit und Lebensfähigkeit nachgewiesen MACS getrennt Monozyten 22,30 verwendet.
Die aktuelle Studie präsentiertEin Vergleich zwischen den zwei Verfahren zur Herstellung von humanen DCs aus Monozyten aus PBMCs isoliert: 1) monocyte Isolierung durch Adhärenz und 2) monocyte Isolierung durch negative Selektion Kommerzielle menschlichen Monocyten Anreicherungs Kit. Diese Studie liefert Hinweise darauf, dass die negative Selektion magnetische Trennverfahren Monozyten erzeugt die höchste Ausbeute an Monozyten keine signifikanten Unterschiede in Monozyten Lebensfähigkeit zu isolieren, wenn sie mit isolierten Monozyten durch die Einhaltung Methode verglichen. Wiederum nach sieben Tagen, die durch magnetische Trennung getrennt Monozyten in MDDCs differenziert mit deutlich höheren proliferative Kapazität und höhere Menge an Zellen, die doppelt positiven (+ CD11c / CD14 +) Phänotyp ohne MDDC Lebensfähigkeit zu beeinträchtigen. Insgesamt unterscheidet sich die aktuelle Studie aus den bisherigen Studien oben Bezug genommen wurde, da es die Fähigkeit beider Techniken demonstriert gleichzeitig Monozyten erzeugen, die von wuchernden fähig sind und Differenzierung in CD11c +MDDCs (> 70%) nach sieben Tagen in Kultur ohne ihre Lebensfähigkeit zu beeinträchtigen. Darüber hinaus bietet der derzeitige Ansatz zum ersten Mal Charakterisierung verschiedener CD11c / CD14 MDDCs Populationen von Abbildungs Durchflusszytometrie.
Zusammengefasst, da DCs eine Brenn Rolle in Bezug auf die Forschung im Bereich der Immunologie spielen, müssen verschiedene Parameter berücksichtigt werden , wenn man bedenkt , wie sie abgeleitet sind und welche sind Methoden verwendet , um sie in vitro zu isolieren und Kultur. Daher zielt diese Studie Erkenntnisse über zwei verschiedene Methoden der Monozyten-Isolierung und wie diese Methoden unterschiedlich Monozyten Lebensfähigkeit und Ausbeute schließlich dendritischen Zellen Lebensfähigkeit, Proliferation zu beeinflussen, und Phänotyp beeinflussen. Diese Ergebnisse werden stark auf dem Gebiet der Immunologie beitragen und ein ausführliches Protokoll der DC-Isolierung, Reinigung und Charakterisierung liefern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Basierend auf den bekannten Schwierigkeiten bei der Isolierung und MDDCs aus menschlichem Blut, ist die vorliegende Studie zielte darauf ab, um einen umfassenden Vergleich von zwei etablierte Methoden zur Erzeugung von MDDCs erzeugen. Das erste Verfahren ist im Vergleich eine gut etablierte traditionelle Methode zur Erzeugung MDDCs durch die Fähigkeit der Monozyten Ausnutzen auf Glas oder Kunststoff (Adhärenz – Methode) 21,22,27 haften. Die Einhaltung Methode ist schnell und kostengünstig, und erfordern ni…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research is supported by the National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism, award K99/R00 AA021264. Additional lab support as part of startup package has been received from the Department of Immunology, Institute of NeuroImmune Pharmacology, Herbert Wertheim College of Medicine, and FIU- Office of Research and Economic Development. Gianna Casteleiro was supported by NIH/NIGMS R25 GM061347. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-5442-03 | Must be used at room temperature |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010-023 | |
| ACK Lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Life Technologies | 15240-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| RoboSep buffer | StemCell | 20104 | |
| EasySep Human monocyte enrichment kit | StemCell | 19059 | |
| TC20 Automated cell counter | Bio-Rad | 145-0101 | |
| FITC-Dextran | Sigma Aldrich | FD4-100MG | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | |
| Synergy 2 multi-mode reader | Biotek | 7131000 | |
| XTT Sodium salt bioreagent (XTT) | Sigma Aldrich | X4626-100MG | |
| Dimethyl sulfoxide bioreagent (DMS) | Sigma Aldrich | D8418-500ML | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) | Sigma Aldrich | m5655-500MG | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad | 161-0302 | |
| Phenazine Methosulfate (DMSO) | Sigma Aldrich | P9626-1G | |
| Inactivated (HI) Human Serum | Chemicon | S1-100ML | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | BD Accuri | 653119 | |
| FlowSight Amnis Flow Cytometer | EMD Millipore | 100300 |
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