Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) und Genexpressionsanalyse von Fos-exprimierenden Neurone von Frische und Gefrorene Rattenhirngewebe

Summary

Hier präsentieren wir eine Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) Protokoll zu untersuchen molekulare Veränderungen in Fos-exprimierenden neuronalen Ensembles aus frischen und gefrorenen Hirngewebe. Die Verwendung von gefrorenem Gewebe ermöglicht FACS Isolierung von vielen Bereichen des Gehirns über mehrere Sitzungen hinweg die Verwendung von wertvollen tierischen Patienten zu maximieren.

Abstract

Die Studie der Neuroplastizität und molekularen Veränderungen in erlernten Verhaltensweisen aus der Studie von ganzen Hirnregionen zur Untersuchung spezifischer Sätze von spärlich verteilten aktivierten Neuronen Schalt neuronalen Ensembles genannt, die Verbände vermitteln gelernt. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) wurde vor kurzem für erwachsene Rattenhirngewebe und erlaubt die Isolierung von aktivierten Neuronen optimiert Antikörpern gegen den neuronalen Marker NeuN und Fos Protein, ein Marker der stark aktivierten Neuronen verwenden. Bisher Fos-exprimierenden Neuronen und anderen Zelltypen wurden aus frischem Gewebe isoliert, die lange Bearbeitungs Tage und erlaubt sehr begrenzte Anzahl von Gehirnproben brachte nach langwierigen und komplexen Verhaltensverfahren beurteilt werden. Hier fanden wir , dass die Renditen von Fos-exprimierenden Neuronen und Fos mRNA aus dorsalen Striatum ähnlich waren zwischen frisch sezierten Gewebe und Gewebe bei -80 ° C eingefroren 3 - 21 Tage. Zusätzlich bestätigten wir den Phänotypder NeuN-positive und NeuN-negativ sortierten Zellen durch die Bewertung der Genexpression von neuronalen (NeuN), astrozytären (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) und microgial (Iba1) Marker, die das gefrorene Gewebe für FACS Isolierung kann auch verwendet werden , von Glia-Zelltypen. Insgesamt ist es möglich, zu sammeln, zu sezieren und Hirngewebe für mehrere FACS Sitzungen einzufrieren. Dies maximiert die Menge von Daten von wertvollen tierischen Subjekten erhalten, die oft schon lange und komplexe Verhaltensverfahren unterzogen.

Introduction

Während des Lernens bilden Tiere Assoziationen zwischen komplexen Sätzen von hochspezifische Reize. Diese hochauflösende Informationen wird angenommen, dass durch Veränderungen in spezifischen Mustern von spärlich verteilten Neuronen genannt neuronalen Ensembles codiert werden. Neuronale Ensembles durch die Induktion von unmittelbar frühen Gene (IEGs) wie Fos, Arc und Zif268 und ihre Proteinprodukte in Neuronen identifiziert , die waren stark aktiviert während Verhalten oder Cue - Exposition vor kurzem wurde. Fos-exprimierenden Neuronen insbesondere gezeigt wurden ^1-4 kausalen Rollen in Zusammenhang und Cue spezifische erlernten ....

Protocol

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) der National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren ¹⁶ durchgeführt.

Hinweis: Alle Schritte unter Verwendung schwach bindende Zentrifugenröhrchen, die auf Eis gehalten wurden, sofern nicht anders angegeben.

1. Vorbereitung vor dem Gewebeentnahme

1. Stellen Sie die Zentrifuge bis 4 ^o C.
2. Feuerpolitur ein Satz von drei Glaspasteurpipetten mit abnehmendem Durchmesser von ca. 1,3, 0,8 und 0,4 mm für jede Probe.
3. Bereiten Sie markier....

Results

Sortierung Fos-positive und Fos-negativen Neuronen aus frischen und gefrorenen dorsalen Striatum Gewebe aus einzelnen Ratten nach akuter Methamphetamin Injektionen.

Die oben beschriebenen Protokoll wurde verwendet, Fos-positiven und Fos-negativer Neuronen von einer einzigen Ratte dorsalen Striatum 90 Minuten nach einer intraperitonealen Injektion von Methamphetamin zu sortieren (5 mg / kg). Naïve Ratten in ihre Käfige wurden a.......

Discussion

FACS verwendet werden Neuronen zu sortieren und andere Zelltypen entweder frisch oder gefroren adult Hirngewebe. Wie in der Einleitung erwähnt, ermöglicht die Fähigkeit, gefrorene Gewebe zu verwenden, eine optimale Nutzung von Proben von Tieren, die komplexe und langwierige Verhaltensverfahren, wie zum Beispiel Selbstverwaltung und Rückfall-Studien in der Suchtforschung unterzogen wurden. Diese Verhaltensverfahren dauert in der Regel 1 bis 2 Stunden oder länger, und verlangen , dass alle Tiere (10 - 20 insgesamt) am sel.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gehirnmatrix	CellPoint Scientific	69-2160-1	zur Gewinnung von koronalen Hirnschnitten
Hibernate A mit niedriger Fluoreszenz	Brain Bits	HA-lf	Puffer A im Protokoll wird für die Verarbeitung von Gewebe und Zellen von der Dissoziation bis zu den Fixierungsschritten verwendet
Accutase	Millipore	SCR005	Die Enzymlösung im Protokoll wird für den enzymatischen Verdau von Gewebe vor der Verreibung verwendet
Protein LoBind Tube 1,5 ml, PCR clean	Eppendorf	22431081	zur Verhinderung von Zellverlusten während des Protokolls
Cell Strainer, 40 & micro; m	BD Falcon	352340	zum Filtern der Zellsuspension
Cell Strainer, 100 & micro; m	BD Falcon	352360	zum Filtern der Zellsuspension
Falcon 5 ml Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden und Schnappkappe des Zellsiebs	BD Bioscience	352235	zum Filtern der Zellsuspension vor dem Passieren des Durchflusszytometers
Pasteur Pipet, Glas	NIH-Versorgung	6640-00-782-6008	zur Gewebeverreibung
Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Klon A60 (monoklonal) Antikörper	EMD Millipore	FCMAB317PE	Antikörper zum Nachweis von Neuronen
Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Konjugat)	Zellsignaltechnologie	8677	Antikörper zum Nachweis von Fos-exprimierenden Zellen
DAPI	Sigma	D8417	zur Markierung von Zellkernen
PicoPure RNA Isolation Kit	Applied Biosystems.	KIT0204	Das Kit enthält den RNA-Extraktionspuffer für Schritt 6.14. Es wird verwendet, um sortierte Zellen zu sammeln
Superscript III Erststrang cDNA-Synthesesystem	Invitrogen	18080-051	zur Synthese von cDNA aus RNA
TaqMan PreAmp Master Mix	Applied Biosystems.	4391128	zur gezielten Präamplifikation mit dem cDNA
TaqMan Advance Fast Master	Angewandte Biosysteme.	4444963	führt man PCR mit TaqMan-Sonden
durch, Fos TaqMan Sonde	Applied Biosystems.	Rn00487426_g1	TaqMan Sonde/Primer
NeuN TaqMan Sonde	Applied Biosystems.	CACTCCAACAGCGTGAC	Nukleotidsequenz für neuronale Genmarker
NeuN Forward primer	Applied Biosystems.	GGCCCCTGGCAGAAAGTAG	Nukleotidsequenz für neuronale Genmarker
NeuN Reverse Primer	Applied Biosystems.	TTCCCCCTGGTCCTTCTGA	Nukleotidsequenz für neuronale Genmarker
Gfap TaqMan Sonde	Angewandte Biosysteme.	Rn00566603_m1	TaqMan-Sonde/Primer für astrocityc-Genmarker
iba-1 TaqMan-Sonde	Applied Biosystems.	Rn00574125_g1	TaqMan-Sonde/Primer für Mikroglya-Genmarker
Gapdh TaqMan-Sonde	Applied Biosystems.	CTCATGACCACAGTCCA	Nukleotidsequenz als Referenz/Haushaltsgene
Gapdh Forward Primer	Applied Biosystems.	GACAACTTTGGCATCGTGGAA	Nukleotidsequenz als Referenz/Haushaltsgene
Gapdh Reverse Primer	Applied Biosystems.	CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA	Nukleotidsequenz als Referenz/Haushaltsgen
Oligo2 TaqMan-Sonde	Applied Biosystems.	Rn01767116_m1	TaqMan Sonde/Primer für oligodendrozytäre Genmarker
P1000 Pipettierer	Rainin	17014382	Es wird in den Schritten 3.1 und 3.3 für eine milde Gewebeverreibung und in Schritt 6.7 für die Resuspendierung von Zellen als die Pipette mit einem großen Spitzendurchmesser bezeichnet
7500 Schnelles Echtzeit-PCR-System	Applied Biosystems.	446985	für quantitative PCR
FACSAria I Cell Sorter	BD Biosciences		für die FACS-Sortierung