液体クロマトグラフィー/質量分析によってフグ種を遺伝子型決定するための改良されたポリメラーゼ連鎖反応 – 制限断片長多型法が記載されています。逆相シリカモノリスカラム消化アンプリコンを分離するために使用されます。この方法は、ベース組成物を同定するのに有用であるオリゴヌクレオチドのモノアイソトピック質量を、解明することができます。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)-restriction断片長多型(RFLP)液体クロマトグラフィー/エレクトロスプレーイオン化質量分析(LC / ESI-MS)により毒性フグ種の遺伝子型を決定するための方法の改良が記載されています。 DNA抽出は、シリカ膜ベースのDNA抽出キットを用いて行われます。界面活性剤を含まないPCR緩衝液を用いてPCR増幅した後、制限酵素反応液を精製せずに溶液に添加されます。逆相シリカモノリスカラム及びフーリエ変換は、修正キングドントラップ分析器を有する高分解能質量分析計は、それぞれ、分離および検出のために使用される変換します。 400mMの1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール、15mMのトリエチルアミン(pHは7.9)及びメタノールからなる移動相は、0.4 ml /分の流速で送達されます。 LC / ESI-MS分析のためのサイクル時間は、カラムの平衡化を含む、8分です。同位体分布モデルOを有するデコンボリューションソフトウェアオリゴヌクレオチドfの質量スペクトルから、対応するモノアイソトピック質量を計算するために使用されます。オリゴヌクレオチド(範囲26から79ヌクレオチド)の分析のために、質量精度は0.62±0.74 ppm以下(N = 280)であり、優れた精度と精度は、ロック質量標準を使用せずに180時間持続しました。
質量分析(MS)は、イオン1,2に使用される核酸は、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)およびエレクトロスプレーイオン化(ESI)の迅速かつ信頼性の高い同定のための受け入れられた技術です。 MALDI技術は、典型的には、飛行時間型(TOF)分析器と組み合わされます。しかし、MALDI-TOF MSのアプリケーションは短いオリゴヌクレオチドに限定されている(〜25ヌクレオチド(nt))その後の断片化、付加体形成と低イオン化効率1,2による。対照的に、ESIは、より長いオリゴヌクレオチド(> 100塩基)に適用可能であるが、複数の多くの電荷状態イオン荷電([M-NH] N-)生体高分子から同時に生成され、従って、分析物の質量は、上部を超えること分光器のm / z範囲の限界。これは、複雑なスペクトルの解釈を必要とする、 すなわち 、対応するマスに電荷状態系列の形質転換デコンボリューションを経由。
小分子の質量測定、モノアイソトピック質量のピーク、 すなわちの場合、各要素の唯一の最も一般的な同位体を含む分子の質量が最も豊富であり、3自然観察しました。分子量が増加するにつれて、より高いのm / z及びモノアイソトピックピークの同位体分布のシフトは、ベースラインノイズ3-5によって不明瞭になります。モノアイソトピックピークは10 kDaの3より大きい大衆のためにはもはや検出すると、平均分子量が測定ではなく、モノアイソトピック質量5のために使用されていません。このような場合、個々のピークのそれぞれ1ダによって分離された同位体分布のみを観察することができる場合TOF、フーリエキングドントラップ分析器6を修飾変換、またはフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴のような高分解能質量分析計分析装置は、分析のために使用されます。しかし、最も豊富なピークのありますometimes平均分子量5と一致していません。これらの問題は、正確な分析物を決定するための困難につながる可能性があります。
安定同位体の天然存在度の変動と平均分子量を決定する際の難しさを考えると、モノアイソトピック質量の測定は、生体分子3,4の質量特性評価に最適です。実際には、モノアイソトピックピークが観察できるかどうか、モノアイソトピック質量は、モデル検体4,7-10から計算理論的に観察された同位体分布パターンを比較することによって推定することができます。フィッティングアルゴリズム8は現在、独自のソフトウェアに組み込まれています。
ESI-MSの文脈において、DNA二重鎖、精製および脱塩の解離によるイオン抑制及び付加物形成2,10-14にイオン化の失敗を回避するために、直接測定するために必要とされます。これらの手順はtroublありますesomeは、しかしながら、完全に自動化された分析システムは、病原体15~20を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、試料調製及びESI-MS含む商業的に開発されてきました。別のアプローチは、分離用液体クロマトグラフィー(LC)を導入されています。 LCが共存する物質からの検体のオンライン分離を提供し、21,22をイオン化する前に面倒な試料調製を必要としません。しかし、MS適合性移動相を用いた核酸の分離は、そのようなヌクレオチドのポリアニオン性質により、薬物、ペプチドおよびタンパク質などのほとんどの他の化合物に比べてより困難です。 LC / ESI-MSの最も成功した例は、イオン対逆相LCの使用を含みます。 1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール(HFIP) -トリエチルアミン(TEA) -メタノールの移動相は、最初Apffel らによって提案された。短いオリゴヌクレオチド23を分離して検出します。 differentiatioのためのLC / ESI-MSジェノタイピングの応用病原体種、一塩基多型および短いタンデムリピートのNは、より長いオリゴヌクレオチド1,21,24-33を分離することができるキャピラリーポリマーモノリスカラムを使用して報告されています。
日本とアメリカでは、深刻な食中毒は誤認やフグの不適切な準備が原因で発生しているが、これはフグの分布と準備が厳密に食品の安全性の法律34,35によって制御されているにもかかわらずです。また、フグエキスを使用して、意図的な殺人は日本36で発生しました。したがって、フグ種の分化は、公衆衛生とフォレンジック調査の観点の両方から必要とされます。 トラフグはフグの他の種類よりもはるかに高価であるためさらに、分化能力はまた、食品詐欺の調査との関連で必要とされます。
ここで、Mを決定するための詳細な方法逆相シリカモノリスカラムおよび高分解能質量分析計を用いてLC / ESI-MSによるPCR産物のonoisotopic質量が記載されています。具体的には、アプローチは、MSを使用して、動物の種分化の最初の例であるPCR制限酵素断片長多型(RFLP)法37の使用に基づく毒性フグ種の分化を可能にするために開発されました。
DNAを抽出するために、血液及び組織からDNAを抽出するための市販のキットには、軽微な修飾(プロテイナーゼKの量と溶解液の遠心分離)を用いて、製造業者のプロトコルに従って使用されています。しかし、任意の抽出キットであれば、細胞DNAをPCRのために適切な回収および純度で抽出できるように使用することができます。この方法は、筋肉、フィン、肝臓、卵巣、および皮膚37を使用してテストされています。フィンが原因、凍結、乾燥沸騰させ、焼きフグサンプルが正常に37試験したプロテイナーゼK新鮮な、と迅速な溶解を可能にする大きな表面積、特に適しています。
PCRプライマーセット( 表1)フグのために設計され、フグのミトコンドリア16SリボソームRNA遺伝子を増幅します。増幅する標的DNAは、114から115塩基対(属トラフグ )および86塩基対(属サバフグ属 )( 表5)です。メソッドのdevelopmeを容易にするために、NT、標的配列を有する合成されたオリゴヌクレオチドの代わりに本物のフグ標本を収集する基準のために使用しました。プライマーセットは、目的に応じて設定され、別のプライマーで置き換えることができ、しかし、酵素消化後の最終的なDNAの長さは、成功したデコンボリューションのために必要な質量スペクトルの品質を維持する観点から、NT 100未満であるべきです。加えて、標的オリゴヌクレオチドは、より長い、約75塩基以下である場合にCトラップ中の窒素圧力を減少させるべきであると質量スペクトルの品質が成功デコンボリューションのためには不十分です。そのような制限は、プロトコルセクションに記載したように他の方法でシャーシ内Cトラップするためのバルブを調整する必要があり、機器のソフトウェアにおける最近の進展を介して制御することができます。試料調製用としては、界面活性剤を含まない試薬の使用は、適切なピーク形状、十分なピーク強度と安定した保持時間31の点で、その後のLCのために重要です。
<p class = "jove_content"> PS-DVBキャピラリモノリスカラム21,24-33、C 18逆相微粒子シリカカラム23,40,41および疎水性相互作用クロマトグラフィー(HILIC)カラム42は、LCのために使用されています/オリゴヌクレオチドのESI-MS分析。これらの中でも、キャピラリモノリスカラムは、分離能の点で他のものよりも優れているが、過去の研究で使用されるキャピラリーモノリスカラムは、社内製機器を必要とする低流量(2μL/分)で操作しましたマイクロLCに専念。簡単な操作を容易にするために、商業的に入手可能なカラムは、より高い流量(100-400μL/分)での長いオリゴヌクレオチドを分離するために評価しました。 DNA二重鎖(26、37および53塩基対)の3組は、上記カラムを用いて分離し、但し、C 18 -結合シリカ微粒子カラムおよびPS-DVBモノリスカラムのサイクル時間は、それぞれ、65及び70分でした、Cのそれに対し、 <sub> 18 -結合シリカモノリスカラムは、8分( 図1)でした。考慮に迅速な分析を取って、C 18 -結合シリカモノリスカラムは、限られた分離能力にもかかわらず、我々の目的のために選択しました。しかしながら、改善された分離が必要とされる場合、残りの二つの列を使用してもよいです。理論的には、モノリスカラムの場合、そこには間隙容量はなく、したがって、効率的な分離27を有効に 、一貫性のある経路長を維持しながら、移動相は固相の孔を通って流れるように強制されることになります。このようなプロセスは、大きな分子の遅い拡散として、そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的に生体高分子の分析で明らかにされるであろう。モノリスカラムの実用的な利点の一つは、背圧は粒子状シリカカラム27のそれよりも低いことです。高流速(400μL/分)と低いカラム温度(20°C)の最大背圧にもかかわらずシステムは、12.5 MPaで37でした。これは、長いオリゴヌクレオチドの迅速な分析のためのC 18 -結合シリカモノリスカラムの利点の最初の実証です。高い流速のため、界面でマイクロLCと正確な位置合わせのための専用装置が必要とされません。代わりに、加熱されたESIプローブは、DNA二本鎖を解離し、後述するように、DNAのイオン化を支援するために必要とされます。イオン対クロマトグラフィーは、一般的に、オリゴヌクレオチドのMS適合性の分離のために使用されます。しかし、イオン対試薬は、一般に、ESIプロセスと干渉し、ESI-MSの感度を低下させます。従って、HFIPは、しばしば、オリゴヌクレオチドの感度を向上させるために、移動相のために使用されます。しかし、HFIP(沸点59°C)をメタノール(沸点65℃)の前に界面で急速に蒸発し、従って、溶媒のこの損失は、pHを増加させ、イオン対試薬の解離( すなわち 、TEA)を促進しますオリゴヌクレオチドから。本発明の方法は、350℃の高温の窒素ガスで溶出液をnebulizes加熱ESIプローブを採用しているので、この効果は、上で強調することができます。なぜなら微量金属イオン33との付加物形成の減少のジェノタイピング解析のために、代わりにHFIP-TEA緩衝液の、エルブとOberacherはcyclohexyldimethylammonium酢酸(pHは8.4 CycHDMAA)をお勧めします。著者らは、CycHDMAA自体が金属付加物の形成を抑制することが推定されます。文献にもかかわらず、かなりの付加物の形成は、本発明の方法において観察されませんでした。また、HFIP-TEA-メタノール系の注目すべき利点は、HFIP-TEA-メタノール系で得られたピーク面積は、Tの86塩基対のアンプリコンを分析する際CycHDMAA -アセトニトリル系から得られたものよりも17倍であったということですpoecilonotus(データは示さず)。 HFIP-TEA-メタノール系の一つの欠点は、しかし、CycHDMAA – アセトニトリル系を基準にしてコストの増加です。
モノアイソトピック質量の計算は、多価イオンの同位体ピークの分離が必要です。したがって、解像度は今回の解析のために重要です。必要な分解能は、検体の塩基対の長さに依存するが、数万の分解能を有する従来のTOF分析器は、短いオリゴヌクレオチドの分析のために制限され得ます。
表4に示す理論的モノアイソトピック質量は、分析物の対応する塩基組成から計算しました。あるいは、マディマンらは、正確な質量43の塩基組成を計算するソフトウェアアプリケーションを開発しました。同様のプログラムは、自動化されたESI-MSシステム16-18に統合されました。測定されたモノアイソトピック質量は常にユニークな塩基組成のOに対応していないため、これらのアルゴリズムの使用は、本方法の堅牢性を向上させることができます必然的な測定誤差に起因する3 ppm以下の質量公差翼。残念ながら、我々は本研究のためにこれらのソフトウェア製品を入手することができませんでした。
本発明の方法は、塩基組成の分析に基づいており、具体的にフグ用に設計された手順を必要としないので、本モノアイソトピック質量ベースの種決意はフグの分化のためだけでなく、他のDNA多型の検出のためだけでなく、適切であり得ます。 DNA多型の検出のためのように、専用のESI-MSシステムは、病原体15,17,18,20,30の検出などの診断用途に適していることができる、完全に自動化され、操作が容易です。逆に、本発明の方法は、したがって、研究用途に適した一般的な研究機器および装置で可能であると。 ESI-MSは、既に一塩基多型13,28,32、短いタンデム反復26ヒトDNA多型に適用されています、およびミトコンドリアDNAは16,19を analsis。マイクロRNAはまた、キャピラリーLC / ESI-MS 44を介して分析しました。これらの公開された出願はまた、本発明の方法によって実現することができます。また、この方法は、オリゴヌクレオチドおよびそのような抗生物質及び低温分離によりリボソームRNA 45との相互作用のような低分子量化合物との間の相互作用をモニターするために適切であり得ます。このような場合には、オリゴヌクレオチドおよび低分子量化合物を同時に検出する必要があり、LC / ESI-MSを使用することの利点です。
インスツルメンテーションは、サンガー配列決定およびリアルタイムPCRのような従来の技術のように平行分析を行うのに適していないという制限があります。さらに、本方法は、ベース組成物と同じ分子内の任意の塩基置換を区別することができない特定します。しかしながら、ここで説明MSベースのDNA分析は、まだ項のメリットを有していてもよいです例えば、ゲル電気泳動およびリアルタイムPCRのようなDNA結合色素ベースの技術と比較して精度のS。
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research by the Japanese Society for the Promotion of Science (15K08060).
DNeasy Blood & Tissue Kit (50) | Qiagen | 69504 | DNA extraction kit |
Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
Ethanol (99.5+ vol%) | Wako | 054-07225 | For dilution of wash buffers |
TE buffer (pH 8.0) | Wako | 310-90023 | For dilution of DNA sample |
PCR primer | Fasmac | NA | Purified with reverse-phase cartridge column by the supplier |
Template DNA | Eurofins Genomics | NA | Purified by HPLC by the supplier |
Ultrapurified water | NA | NA | Generated with a Milli-Q Direct water purification system (Merck Millipore), used for sample preparation |
Detergent Free 5X Phusion HF Buffer | Thermo Fisher | F-520L | Use instead of the provided buffer of DNA polymerase |
Pfu-X DNA polymerase | Jena Bioscience | PCR-207S | |
dNTP mix (20 mM each) | Jena Bioscience | NA | Supplied with the DNA polymerase |
10× Universal buffer M | Takara Bio | NA | Containing 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol and 500 mM NaCl |
Dra I | Thermo Fisher | FD0224 | Restriction enzyme |
Msp I | Thermo Fisher | FD0544 | Restriction enzyme |
1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Fluka | 42060-50ML | Eluent additive for LC-MS grade. |
Triethylamine (TEA) | Fluka | 65897-50ML | Eluent additive for LC-MS grade. |
Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | For preparation of calibrant. |
Sodium hydroxide (1.0 M) | Fluka | 72082 | Dilute to 10 mM with ultrapurified water and use for titration of trifluoroacetic acid. |
Acetonitrile | Fluka | 34967 | For preparation of calibrant, LC/MS grade. |
Methanol | Kanto | 25185-76 | For mobile phase, LC/MS grade. |
Water | Thermo Fisher | W6-1 | For mobile phase, LC/MS grade. |
Microcentrifuge tube (0.5 ml) | Eppendorf | 0030123301 | PCR clean grade |
Microcentrifuge tube (1.5 ml) | Eppendorf | 0030123328 | PCR clean grade |
UVette | Eppendorf | 0030106300 | Disposable UV cuvette. |
Gel Green | Biotium | 41004 | Fluorescent DNA stain |
Cosmospin filter G (0.2 μm) | Nakalai Tesque | 06549-44 | Made of hydrophilic polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane. Any centrifugal filter unit (pore size, 0.2–0.5 μm) made of hydrophilic PTFE or another low-binding membrane is applicable. |
300-μl PP screw vial | American Chromatography Supplies | V0309P-1232 | |
Preassembled screw cap and septa | Finneran | 5395-09R | |
Monobis C18 analytical column (2.0×50 mm, mesopore size = 30 nm) | Kyoto Monotech | 2050H30ODS | Outside Japan, available for purchase from GL Sciences via its distributors. (http://www.glsciences.com/distributors/) |
Monobis C18 guard column | Kyoto Monotech | GCSET-ODS3210 | Holder included. |
Cadenza CW-C18 (3.0×250 mm) | Imtakt | CW036 | C18-bonded particulate silica column |
ProSwift RP-4H (1.0×250 mm) | Thermo Fisher | 066640 | Poly(styrene-divinylbenzene) monolith column |
Themo Mixer C | Eppendorf | 5382 000.023 | For digestion of fish tissues. |
Spectrophotometer | Shimadzu | UV-3150 | Quantification of DNA concentration. |
Thermal cycler | Bio-Rad | T100 | |
Portable refrigerator | Twinbird | D-CUBE | For aqueous mobile phase to avoid evaporation of HFIP. This can be replaced by an ice box. |
Ultimate 3000 liquid chromatograph | Thermo Fisher | NA | |
Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher | NA | Fourier transform mass spectrometer equipped with the modified Kingdon trap analyzer. |
Protein deconvolution 3.0 | Thermo Fisher | NA | Use version 3.0 or higher having an isotopic patter model of nucleotide. |