Herstellung von homogenen MALDI Proben für die quantitative Anwendungen

Zusammenfassung

Ein Protokoll für die räumliche Heterogenitäten der Ionensignale in der MALDI-Massenspektrometrie Reduzierung von Substrattemperatur während der Probentrocknungsprozesse regulieren demonstriert.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll demonstriert eine einfache Probenvorbereitung zur Reduzierung der räumlichen Heterogenität in Ionensignalen während der matrixgestützten Laserdesorption/Ionisation (MALDI) Massenspektrometrie. Die Heterogenität der Ionensignale ist ein schwerwiegendes Problem in MALDI, was zu einer schlechten Reproduzierbarkeit der Daten führt und MALDI für die quantitative Analyse ungeeignet macht. Durch die Regulierung der Probenplattentemperatur während der Probenvorbereitung können thermisch induzierte hydrodynamische Strömungen in den Tröpfchen der Probenlösung das Heterogenitätsproblem reduzieren. Eine Probenvorbereitungskammer bei Raumtemperatur, die mit einem temperaturgeregelten Kupferbasisblock ausgestattet ist, der MALDI-Probenplatten aufnimmt, ermöglicht eine präzise Kontrolle der Probentrocknungsbedingungen. Nach dem Trocknen der Probentröpfchen wird die Temperatur der Probenplatten wieder auf Raumtemperatur gebracht und für die anschließende massenspektrometrische Analyse aus der Kammer entnommen. Die Bereiche der Proben werden mit der MALDI-bildgebenden Massenspektrometrie untersucht, um die räumliche Verteilung aller Komponenten in der Probe zu erhalten. Im Vergleich zum herkömmlichen Verfahren mit getrockneten Tröpfchen, bei dem Proben unter Umgebungsbedingungen ohne Temperaturkontrolle präpariert werden, weisen die Proben, die mit dem hier demonstrierten Verfahren hergestellt wurden, eine signifikant bessere räumliche Verteilung und Signalintensität auf. Beobachtungen mit Kohlenhydrat- und Peptidproben zufolge kann die Senkung der Substrattemperatur bei gleichzeitiger Beibehaltung der Umgebungstemperatur während des Trocknungsprozesses die Heterogenität der Ionensignale effektiv reduzieren. Diese Methode ist allgemein auf verschiedene Kombinationen von Proben und Matrizen anwendbar.

Einleitung

Massenspektrometrie (MS) ist eine der wichtigsten Analysetechniken zur Analyse der molekularen Zusammensetzung komplexer Proben. Unter allen Ionisationsmethoden, die bei MS eingesetzt werden, ist die matrixgestützte Laserdesorption/Ionisation (MALDI) die empfindlichste und am weitesten verbreitete Methode in bioanalytischen Anwendungen. ¹ Im Vergleich zu anderen Ionisationstechniken hat MALDI die höchste Empfindlichkeit und hohe Toleranz gegenüber Salzverunreinigungen. Diese analytischen Eigenschaften machen MALDI zur ersten Wahl für die Kohlenhydratanalytik und viele Proteomik-Anwendungen. Die Probenvorbereitung ist jedoch ein entscheidender Schritt, um qu....

Protokoll

Hinweis: Dieses Protokoll zur Reduzierung der räumlichen Heterogenität Maltotriose und Bradykinin-Fragment (1-7) hergestellt, mit dem getrockneten Tröpfchen Verfahren entwickelt wird. Das Protokoll besteht aus drei Hauptschritte, einschließlich der Vorbereitung und Präkonditionierung, Probenablage und Trocknung und Massenspektrometrie Datenanalyse. Die Verfahren werden beschrieben und im Folgenden näher beschrieben:

1. Vorbereitung und Präkonditionierung

1. Reinigen der Probenplatte
   1. Tragen Sie Handschuhe aus Nitril und Hand waschen Sie die Probenplatte vorsichtig mit Reinigungsmittel und destilliertem entionisiertem Wasser (DDW).
   2. Sp....

Ergebnisse

Die Hellfeld - Bilder sowie die MS Bilder von Maltotriose und Bradykinin - Fragment (1-7) hergestellt , mit Probenplattentemperatur von 5 und 25 ° C sind in 1 gezeigt. Im Fall der sodiated Maltotriose, das Ionensignal hauptsächlich bevölkert an der Peripherie des Gebietes Probe, wenn es mit einer Probe Plattentemperatur von 25 ° C hergestellt. die Probenplatte Temperatur auf 5 ° C, füllt das Signal homogen über die gesamte Probenfläche Durch die Verringerung. Der einzige.......

Diskussion

Basierend auf früheren theoretischen Vorhersagen, temperaturbedingten hydrodynamischen Strömungen innerhalb Tröpfchen nach außen Kapillare fließt überwinden durch Verdampfen des Lösungsmittels induziert. Die Effizienz solcher interne Rezirkulation von Molekülen wird erhöht, wenn die Temperatur innerhalb eines Tröpfchens Zunahme Steigungen. Entsprechend den vorhergesagten Ergebnissen, wenn die Probenplatte Temperatur unter 5 ° C gehalten wurde, während seine Umgebung bei Umgebungstemperatur gehalten wird, ist die mittler.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Reagenz
Detergent Pulver	Alconox	242985
Methanol	Merck	106009
Acetonitril	Merck	100003
2,4,6-Trihydroxyacetophenon (THAP)	Sigma-Aldrich	T64602
Bradykinin-Fragment (1-7)	Sigma-Aldrich	B1651
Maltotriose	Sigma-Aldrich	47884
Pipettenspitzen	Mettler Toledo	17005091
Mikrozentrifugenröhrchen	Axygen	MCT-150-C
Equipment
Milli-Q Wasseraufbereitung System	Millipore	ZMQS6VFT1
Puderfreie Nitrilhandschuhe	Microflex	SU-690
600 ml Becherglas	Duran	2110648
Ultraschallreiniger	Delta	DC300H
Hygrometer	Wisewind	5330
Stickstoffgas-Durchflussmesser	Dwyer	RMA-6-SSV
K-Typ Thermoelemente	Digitron	311-1670
Zentrifuge	Select BioProducts	Force Mini
Pipette	Rainin	pipet-lite XLS
Stereomikroskop	Olympus	SZX16
Temperatursteuerbare Trockenkammer	für dieses Labor
Synchronisiertes Dual-Polarity Time-of-Flight Imaging Massenspektrometer (DP-TOF IMS)	für dieses Labor
MALDI-TOF Edelstahl-Probenziel	für dieses Labor