Visuelle kemotaksiassays er afgørende for en bedre forståelse af, hvordan eukaryote celler styrer kemoattraktant-medieret retningsbestemt cellevandring. Her beskriver vi detaljerede metoder til: 1) realtid, høj opløsning overvågning af flere kemotaksiassays, og 2) samtidig visualisering af kemoattraktant gradient og spatiotemporale dynamik signalering begivenheder i neutrofil-lignende HL60 celler.
Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.
Eukaryote celler sanse og bevæge sig mod den højere koncentration inden for en kemoattraktant gradient, en cellulær proces benævnt som chemotaxis. Kemotaksi spiller kritiske roller i mange fysiologiske processer, såsom embryogenese 1, neuron mønsterdannelse 2, metastase af cancerceller 3, rekruttering af neutrofiler til inflammationssteder 4, og udvikling af modelorganismen Dictyostelium discoideum 5. Generelt eukaryote celler fornemmer kemoattraktanter vha G-proteinkoblede receptorer 5. Indgrebet af kemoattraktanter med disse receptorer fremmer dissociation af de heterotrimere G-proteiner Ga og Gβγ, som igen aktiverer nedstrøms signaltransduktionsveje der i sidste ende regulerer Spatiotemporal organisering af actincytoskelettet at drive cellemigrering 5-9.
Cell biologer har været at udvikle og forbedre chemotaxer analyser at undersøge, hvordan G-protein-koblede receptor (GPCR) signalering medierer rettet celle migration. Den Boyden kammer eller transwell migration assay blev udviklet i 1960 af Boyden 10. Assayet fungerer ved at oprette en gradient af kemotiltrækkende forbindelser mellem to brønde, der er adskilt af en mikroporøs membran. Dens enkelhed og brugervenlighed gør det til det mest udbredte kemotaksiassay til dato. Men for at assayet ikke gør det muligt at migrere processen af cellerne visualiseres. Den Zigmond kammer er den første visuelle mikrofluid anordning, der tillader tydelig billeddannelse af cellemigrering på et dækglas over en smal indsnævring mod en kilde kemoattraktant 11. Dunn 12 og Insall 13 modificeret og forbedret høj opløsning og langsigtet billeddannelse evne Zigmond kammer kemotaksi assay. På grund af de meget forudsigelige, diffusion-dominerende karakteristika væskestrøm, har mikrofluidik været at levere løsninger til næste-Generatipå kemotaksiassays såsom EZ-TAXIScan (en celle mobilitet analyseindretning).
Med stabiliteten af gradienten sikret, indretningen tillader seks kemotaksiassays der skal udføres samtidigt (figur 1A). I modsætning til de retningsbestemt faste gradienter frembragt i de forskellige kammer assays ovenfor, nålen eller mikropipette assay udviklet af Guenther Gerisch genererer en gradient med en bevægelig kilde 14. I assayet er kemoattraktant frigives fra en bevægelig mikropipette til at generere en stabil gradient. Med denne nål assay, fandt forskerne, at forskellige celler genererer pseudopodier med fundamentalt forskellige karakteristika. Anvendelse fluorescerende mikroskopi, var vi i stand til at visualisere gradienten at lette kvantitativ måling i hele 15. I denne undersøgelse beskriver vi detaljerede fremgangsmåder til fremstilling af kemotaktisk HL60 (human promyelocytisk leukæmi) celler, samtidig overvågning af flere kemotaksi ASSAys med cellen mobilitet analyseindretningen, og visualisere GPCR-medieret spatiotemporale dynamik signalmolekyler såsom protein kinase D1 i enkelte levende celler som reaktion på synlige, spatiotemporally styrbare kemotiltrækkende stimuli. Vores avancerede imaging metoder kan anvendes til generelle kemotaksi undersøgelser, og er især egnede til mammale cellekulturer.
I den foreliggende undersøgelse viser vi to eksempler på kemotaksiassays: første, samtidig overvågning af flere kemotaksiassays af cellen mobilitet analyseindretningen; og for det andet, visualisering af kemoattraktant gradient og spatiotemporale dynamik signalering begivenheder i de samme celler i realtid.
Celle mobilitet analyse indretning til flere samtidige kemotaksiassays
I den foreliggende undersøgelse, indførte vi en detaljeret protokol til at udføre flere samtidige kemotaksiassays bruger celle mobilitet analyseindretning. Denne enhed giver brugeren mulighed for at observere cellulære kemotaksi adfærd med en 10X objektiv i konventionel lyse-felt observation. På grund af de diffusionstætte dominerende karakteristika fluidstrømmen, cellen mobilitet analyse enhed genererer meget forudsigelige, stabile gradienter og tillader op til seks kemotaksiassays der skal udføres samtidigt. De kritiske trin i protokollen erat opnå pålidelige gradienter og tilpasse cellerne på terrassen linje. Brugeren skal nøje følge producentens anvisninger for indehaveren samling og injektion af kemoattraktanter og celler. Detaljerede instruktioner er også tilgængelige online. Sammenlignet med alternative kemotaksisplader metoder 11-13,15, denne enhed forbedrer pålideligheden og effektiviteten af kemotaksiassays betydeligt. Fire størrelser af celle mobilitet analyseindretning chip i størrelser på 4, 5, 6, og 8 um er tilgængelige til at rumme forskellige typer og størrelser af celler. Vi fandt, at en 4 eller 5 um celle mobilitet analyseindretning chip er egnet til HL60 og D. discoideum-celler, der er omkring 10-15 um i diameter. , En begrænsning er imidlertid, at denne enhed er ikke egnet til alle typer af celler. Vi havde ringe succes ved hjælp af cellen mobilitet analyseindretningen kemotaksiassay med Raw267.4 celler. Årsagen kan være, at Raw267.4 celler migrerer for langsomt. Den tid, der kræves til effektiv chemotaxis af Raw267.4 celler kan være meget længere end den tid en gradient vedligeholdes af enheden. I stedet en transwell migration assay arbejdede godt for Raw267.4 celler 9. En anden begrænsning er, at fluorescerende observation ikke er mulig med den aktuelle enhed. En fremtidige retning er at overvåge fluorescerende billeddannelse med højere forstørrelse. Dette er muligt med den forbedrede celle mobilitet analyseindretning, som er udstyret med fluorescerende detektion og en 100X objektivlinse. Desuden er antallet af samtidige assays også steget til 12. Alle disse forbedringer lette forbedret gennemløb af kemotaksiassays og observation af subcellulære dynamik i migrerende celler.
Høj transfektionseffektivitet af HL60-celler til at udtrykke fluorescerende protein-tagget protein
HL60-celler er en aktivt dividere leukæmicellelinie og vokse i suspension. Som tidligere rapporteret 18-20, HL60-celler er resistente over for gene overførsel. Både lipid og elektroporation genoverførsel er blevet testet, og højere transfektionseffektivitet blev opnået med elektroporering, som beskrevet detaljeret i afsnit 4. Opnåelse høj levedygtighed efter elektroporering er kritisk for opnåelse af høj transfektionseffektivitet på grund af de alvorlige skader, der følger af elektroporering. Efterfølgende grundig og skånsom celle håndtering kræves, især efter elektroporering. Alle medier skal være forvarmet og forsigtigt tilsat til cellerne i eventuelle skridt efter elektroporation. Det er også afgørende at minimere eksponeringstiden af celler til elektroporation reagens. For at undgå celledød, efter elektroporering, RPMI 1640 elektroporering recovery medium skal lægges til cellerne straks. Vi fandt, at 20% FBS i retableringsmedie giver en meget højere celle recovery rate end 10% FBS. Efter elektroporering, inkubation i RPMI 1640 elektroporering recovery medium i 30 min er kritisk for større levedygtighed og transfektioneffektivitet. For yderligere at øge transfektionseffektiviteten anvendte vi også 4 ug plasmid-DNA pr transfektion, hvilket er næsten det dobbelte mængde plasmid anbefalet af producenten.
Der er to store begrænsninger på elektroporation transfektion: den transiency af proteinekspression og celleantallet grænse (2 x 10 6 celler pr transfektion). I udifferentierede celler, ekspression påvises kun i de første par celledelinger, idet vektor-plasmidet fortyndes til det halve efter hver celledeling. For Den differentierede HL60 celler overlever ikke mere end 48 timer. Som følge heraf forsøgene kræver friske transfektioner 6 timer før forsøget. Celleantallet for én elektroporering opfylder blot minimumskravet for eventuelle biokemiske assays. Med henblik på gentagen brug eller store mængder, anbefales det kraftigt, at en udifferentieret HL60-cellelinje etableres som stabilt udtrykker proteinet af interesse whiCH er blevet mærket med et fluorescerende protein ved en viral vektor, hvis en viral vektor er tilgængelige eller kan konstrueres.
The authors have nothing to disclose.
This work is supported by the intramural fund of NIAID, NIH.
RPMI 1640 Medium GlutaMAX | Life technologies | 61870-036 | |
Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scietific | 11360-070 | |
Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
1M HEPES sterile solution, pH7.3 | Quality Biological Inc. | A611-J848-06 | |
Penicillin streptomycin solution | Fisher Scientific | 15140122 | |
NucleofectorTM 2b | Lonza | AAB-1001 | |
AmaxaTM Cell Line NucleofectorTM Kit V including NucleofectorTM Solution, Singe use pipettes, AmaxaTM certified 100 ml aluminum electrode cuvettes | Lonza | VCA-1003 | |
Lab-Tek chambered #1.0 Borosilicate Coverglass | Nalge Nunc International Inc | 155383 | |
2 % Gelatin solution | Sigma-Aldrich | G1393 | |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
HBSS (Hanks’ Balanced Salt Solution) | Life technologies | 14025-076 | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3803 | |
Single well Lab-Tek II coverglass chambers | Nalge Nunc International Inc | 155361 | |
Four-well Lab-Tek II coverglass chambers | Nalge Nunc International Inc | 155383 | |
Alexa 594 | Thermo Fisher Scientific | A-10438 | |
fMLP | Sigma -Aldrich | F3506-5MG | |
Cover glass thickness 2 22 x 22 mm | Corning | 2855-22 | |
EZ-TAXIScan | Effector Cell Institute, Inc. | MIC-1001 | |
EZ-TAXIScan chip (5 mm) | Effector Cell Institute, Inc. | EZT-F01-5 | |
1701RN 10ul syringe | Hamilton | 80030 | |
Femtotips II Injection tips | Eppendorf | 5242956003 | |
Femtotips II | Eppendorf | 930000043 | |
TransferMan NK2, including motor module, X head with angle adjuster, and Positioning aids. | Eppendorf | 5188900056 | |
DIAS software | Solltech Inc. | ||
LSM 780 META or equivalent confocal microscope with a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens | Carl Zeiss |