Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

إعداد CD4 Published: November 8, 2016 doi: 10.3791/54569
Automatic Translation
1, 1
1Instituto de Investigación en Ciencias Básicas y Aplicadas, Centro de Investigación en Dinámica Celular, Laboratorio de Glicobiología Humana y Diagnóstico Molecular, Universidad Autónoma del Estado de Morelos

Summary

نحن تصف بروتوكول تلوين الأجسام المضادة القياسية لاستخدامها في المجهر لتحديد التعبير الغشاء وتوطين gangliosides في الراحة والسذاجة خلايا CD4 + T الإنسان تفعيلها. كما وصفت هي في الوقت الحقيقي التجارب PCR باستخدام <40000 الخلايا التي لا تتطلب معدات إضافية منخفضة الدخل الحمض النووي الريبي.

Abstract

الطرق الموضحة في هذه الوثيقة لتنشيط خلايا CD4 + T ساذجة في تعليق وتمسكهم في coverslips لتحليل الفحص المجهري متحد البؤر تسمح للتوطين المكاني وتصور gangliosides تشارك في تنشيط الخلايا CD4 + T، هذا التعبير تكملة التنميط التجارب مثل قياس التدفق الخلوي، غرب النشاف أو في الوقت الحقيقي PCR. الكمي التعبير غانغليوزيد من خلال التدفق الخلوي وتوطين الخلوية من خلال الفحص المجهري يمكن الحصول عليها عن طريق استخدام أجسام مضادة لمكافحة غانغليوزيد مع قابلية عالية وخصوصية. ومع ذلك، والمناولة المناسبة للخلايا في تعليق يتضمن علاج لوحات الثقافة لتعزيز الالتزام اللازم لمضان أو اكتساب المجهر متحد البؤر. في هذا العمل، ونحن تصف بروتوكول لتحديد GD3 وGD2 التعبير غانغليوزيد وcolocalization مع TCR خلال السذاجة تنشيط الخلايا CD4 + T. أيضا، الحقيقي رووصف التجارب IME PCR باستخدام <40000 خلايا لتحديد GD3 والجينات سينسيز GM2 / GD2، مما يدل على أن يمكن القيام بها مع عدد قليل من الخلايا ودون الحاجة إلى مجموعات إضافية منخفضة الدخل RNA تجارب التحليل الجيني.

Introduction

خلايا CD4 + T تنسق الاستجابة المناعية من خلال وظائف المستجيب على بعد التنشيط بواسطة مستضد الخلايا 1. دراسة الآليات الخلوية التي يتم التضمين خلال تفعيل تتيح نظرة ثاقبة على العملية الأساسية لجهاز المناعة. ومع ذلك، فإن دراسة خلايا CD4 + T ساذجة يمكن أن تكون معقدة لأنها تمثل السكان قليل جدا من الخلايا في محيط الدم 2.

من خلال الفحص المجهري مضان درسوا عدة تقارير توطين الجزيئات المختلفة المشاركة في تنشيط الخلايا CD4 + T، أساسا البروتينات المرتبطة الغشاء البلازمي 3. وgangliosides وحمض تحتوي على الشحميات السفنغولية السكرية اللعابي وعلى الرغم من أنها قد درس على نطاق واسع في الخلايا العصبية حيث هم وفيرة، وخلايا أخرى مثل الخلايا المناعية التعبير أيضا gangliosides مع وظائف ذات الصلة بيولوجيا 4،5. ذكرنا سابقا ثار خلال تنشيط خلايا CD4 + T ساذجة الإنسان هناك upregulation من α2،8 sialyltransferase ST8Sia 1 (GD3 سينسيز) وسينسيز GM2 / GD2، التي تحفز neoexpression سطح كبيرة من GD2 وupregulation من GD3 غانغليوزيد 6. مزيد من الدراسة من GD3، GD2 وgangliosides آخرين في الخلايا المناعية ضرورية لاستكمال وجهة نظر البروتين على أساس جزئي وظيفة المناعة.

عادة، ويستند دراسة التعبير غانغليوزيد على تقنيات مثل اللوني طبقة رقيقة (TLC) 7، ولكن هذه التقنية لا تسمح للتوطين المكاني للgangliosides في غشاء البلازما أو في مقصورات التحت خلوية، والحد من التحليل البيولوجي.

في هذا العمل، ونحن تصف بروتوكول لتحديد الأجسام المضادة التي تتوسط وتوطين GD3 وGD2 gangliosides في السذاجة خلايا CD4 + T الإنسان وPBMCs بعد مكافحة CD3 / تفعيل مكافحة CD28. مع هذا البروتوكول هو أناالممكن أيضا لتحليل الجينات والتعبير الجزيئي للgangliosides في عدد قليل من الخلايا في تعليق، مع الحصول على صور ذات جودة عالية 6، بالنظر إلى حجم صغير من الخلايا الليمفاوية (9 ميكرون).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم الحصول على الدم المحيطي من المانحين الذكور صحية للموافقة المسبقة عن وموافقة لجنة أخلاقيات لمركز البحوث أون DINAMICA Celular- جامعة أوتونوما ديل استادو دي موريلوس.

1. عزل وتفعيل خلايا الإنسان السذاجة CD4 + T

  1. جمع 2 مل من الدم المحيطي المستمدة من المانحين الإنسان الصحية من خلال الموافقة المستنيرة وتمييع مع 2 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة-EDTA (1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، 2 ملي EDTA، ودرجة الحموضة 7.4). إضافة الدم المخفف ببطء على رأس 3 مل من محلول السكروز مع 1.077 كثافة كما هو موضح سابقا 8.
    ملاحظة: سوف التفاضلية الهجرة خلال الطرد المركزي الناتجة عن الاختلافات في الكثافة يسبب الكريات الحمراء إلى الرواسب تماما، وسوف طبقة من خلايا وحيدة النواة أقل كثافة تشكل أعلاه. و2 مل من الدم المحيطي تقديم ما يقرب من 0.5 × 10 6 خلايا CD4 + T ساذجة بعد purificatiعلى الخطوات.
  2. الطرد المركزي 30 دقيقة في 250 x ج في 21 ° C (استخدام الدوار للأنابيب أسفل مستديرة مع زاوية ثابتة من 30 ملم) مع عدم وجود كسر لتوليد التدرج من خلايا الدم وحيدات النوى المحيطية (PBMCs). بعد الطرد المركزي، وPBMCs يمكن ملاحظتها بوضوح باعتباره حلقة بيضاء. جمع PBMCs مع ماصة ونقل إلى أنبوب معقم للغسيل.
  3. بعد ثلاثة يغسل بمحلول PBS-EDTA في 250 x ج لمدة 10 دقيقة شروع في تنقية خلايا CD4 + T ساذجة. تتوفر طرق الفرز أو عدة أنواع من مجموعات تنقية لهذا الغرض. يفضل استخدام> 1 × 10 7 PBMCs لتنقية.
    1. تنقية خلايا CD4 + T ساذجة عن طريق الانتقاء السلبية مع حبات مغناطيسية. أداء اختيار السلبية المضادة CD45RO، CD8، CD14، CD15، CD16، CD19، CD25، CD34، CD36، CD56، CD123، ومكافحة TCRγ / δ، ومكافحة HLA-DR، وCD235a (glycophorin أ) الأجسام المضادة. تقييم نسبة النقاء من خلال تحديد خلايا CD4 + CD45RA + خلال fالخلوي منخفض.
      ملاحظة: اختياريا، انتقل إلى حضانة PBMCs بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و CO 2 مع كثافة من 1 × 10 6 خلية / مل في 10 مل من المتوسط تستكمل لتشجيع الانضمام الوحيدات ومواصلة تنقية خلايا CD4 + T ساذجة 5٪. واستعادة كفاءة خلايا CD4 + T ساذجة من الدم المحيطي يعتمد إلى حد كبير على نظام تنقية.
  4. إعداد 24 لوحات جيدة زراعة الخلايا بإضافة 250 ميكرولتر لكل بئر من برنامج تلفزيوني مع 5 ميكروغرام / مل مكافحة CD3 الأجسام المضادة وحيدة النسيلة واحتضان لمدة لا تقل عن 2 ساعة على 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: لوحات مع 96 بئرا يمكن استخدامها عندما يتم استخدام عدد أقل من خلايا CD4 + T ساذجة (على سبيل المثال، 2 X10 4 -1 × 10 5).
  5. إزالة مكافحة CD3 الأجسام المضادة تخفيف من 24 جيدا أو 96 لوحات جيدا وتغسل الصحون مرتين باستخدام معقم برنامج تلفزيوني 1X.
  6. تمييع الخلايا CD4 + T ساذجة مع> 95٪ من النقاء (CD4 +CD45RA +) إلى كثافة من 1 × 10 6 خلية / مل في المتقدم المتوسط 1640 RPMI تستكمل مع 3٪ من مصل بقري جنيني (أو RPMI تستكمل مع 10٪ من مصل الدم)، 2 الجلوتامين مم والمضادات الحيوية (1 يو / البنسلين مل، 1 ميكروغرام / مل الستربتومايسين).
    ملاحظة: إذا كان مطلوبا توطين غانغليوزيد في PBMCs، اتبع نفس البروتوكول لتخفيف والتحفيز على النحو المبين أدناه.
  7. إضافة 500 ميكرولتر من التخفيف خلية لمكافحة CD3 الآبار المغلفة والآبار غير المغلفة (الخلايا السيطرة) في 24 لوحة جيدا. بدلا من ذلك، إضافة 100 ميكرولتر من التخفيف الخلية إلى الآبار من 96 لوحة جيدا.
  8. استكمال الشروط تحفيز خلايا CD4 + T ساذجة في مكافحة الآبار CD3 المغلفة بإضافة 1 ميكروغرام / مل من مكافحة الأجسام المضادة CD28.
  9. إبقاء يستريح خلايا CD4 + T وتحكم في الآبار غير المغلفة دون إضافة الأجسام المضادة CD28. احتضان يستريح وتنشيط خلايا CD4 + T لل0-72 ساعة تحت ظروف قياسية من 37 درجةC و 5٪ CO 2.
  10. للتحقق من تفعيل كاف تقييم التدفق الخلوي التعبير عن CD69 تنشيط مبكر علامة (16 ساعة بعد تفعيل) أو CD25 أواخر تنشيط علامة (48 ساعة بعد تفعيل) في راحة وتنشيط السذاجة خلايا CD4 + T المحتضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 في غياب أو وجود لمكافحة CD3 / CD28 الأجسام المضادة 9،10.

2. الالتزام من يستريح والمفعلين خلايا CD4 + T السذاجة

  1. تعقيم 12 ملم coverslips جولة قبل التعقيم والتعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة على الأقل.
  2. مكان coverslips في لوحات ثقافة الخلية 24-جيدا العقيمة.
    ملاحظة: للحصول على الثقافات مع أقل من 1 × 10 5 خلايا فمن الأفضل لاستخدام غرف الشرائح مع آبار صغيرة تكييفها لمنع تشتت خلايا في ساترة.
  3. coverslips معطف (أو غرفة الشريحة) مع 200 ميكرولتر من بولي-L-ليسين (MW 150-300 كيلو دالتون) 0.1٪ (ث / ت) حل واحتضان لمدة 5 دقائق في صدرجة الحرارة أوم (RT)، وإزالة والجافة لا يقل عن 1 ساعة على RT.
  4. مزيج بعناية وجمع يستريح وتنشيط خلايا CD4 + T ساذجة من 24 لوحات جيدا. عد الخلايا وإذا لزم الأمر ضبط مع المتوسط تستكمل جديدة لنقل 1 × 10 5 الخلايا للل coverslips المغلفة بولي-L-يسين. احتضان الخلايا لمدة لا تقل عن 6 ساعات عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.

3. جمع وتثبيت لليستريح والمفعلين السذاجة CD4 + T الخلايا

  1. إزالة بعناية متوسطة من الراحة مثقف وتنشيط خلايا CD4 + T ساذجة.
  2. إضافة 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة RT ببطء.
    ملاحظة: بالإضافة دقيق وإزالة الحلول من الآبار يمنع من الخلايا المفرزة من ساترة.
  3. تجاهل برنامج تلفزيوني وإضافة 500 ميكرولتر برنامج تلفزيوني آخر لإزالة بدقة سائل الإعلام والثقافة.
  4. إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 500 ميكرولتر تصفيتها 4٪ امتصاص العرق (FILTالتموينية يزيل المجهرية الدقيقة التي يمكن أن تتداخل مع التحليل المجهري)، واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT (المفضل) أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    تحذير: لامتصاص العرق هو مركب سام ومتقلبة. ومن المعروف أن يكون مسرطن بشري. استخدام بعناية مع بروتوكول السلامة المناسبة.
  5. إزالة تثبيتي، ويغسل ما لا يقل عن مرتين مع برنامج تلفزيوني في RT.
  6. انتقل إلى الخطوة التالية أو الحفاظ على الآبار لوحة مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لعدة أيام حتى تلطيخ.
    ملاحظة: العقم أثناء هذه العملية يساعد على تجنب نمو الكائنات الحية الدقيقة.

4. تلطيخ، تركيب والتخيل التي كتبها متحد البؤر المجهري

  1. إزالة برنامج تلفزيوني من الآبار. إضافة 500 ميكرولتر من عازلة تمنع الباردة (برنامج تلفزيوني 1X، 0.5٪ معيار درجة زلال المصل البقري، 1٪ مصل بقري جنيني 7.4 درجة الحموضة). احتضان لمدة 20 دقيقة على الجليد.
  2. إزالة عازلة تمنع بعناية وإضافة الأجسام المضادة الأولية (مكافحة gangliosides GD3 استنساخ R24، GD2 استنساخ 14G2a)،مكافحة CD25 PE-مترافق وAPC مترافق مكافحة TCR وisotypes ضوابط مخففة في عرقلة العازلة إلى 2.5 ميكروغرام / مل.
  3. احتضان 2 ساعة على الجليد أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: التحريض المداري البطيء هو الأفضل.
  4. إزالة الأجسام المضادة بعناية وإضافة ببطء 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. كرر مرتين.
  5. إضافة الأجسام المضادة الثانوية (FITC مكافحة IgG3 مترافق لR24 مكافحة GD3، اليكسا فلور 488 مترافق أو فلور اليكسا 647 مترافق مكافحة IgG2a ل14G2a مكافحة GD2) المخفف في عرقلة العازلة إلى 0.1 ميكروغرام / مل.
  6. احتضان لمدة 1 ساعة على الجليد في الظلام دون أن تهتز.
  7. يغسل ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني كما هو موضح في 4.4). إبقاء الآبار مع ما يكفي من برنامج تلفزيوني لتجنب جفاف العينات.
  8. إضافة هويشت 333258 صمة عار المخفف في برنامج تلفزيوني إلى 0.1 ميكروغرام / مل.
  9. احتضان 15 دقيقة في RT وإزالة. يغسل ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني.
  10. ضع الشرائح على منشفة ورقية، وإضافة 20 ميكرولتر من الحل تركيب (50٪ الجلسرين في برنامج تلفزيوني) أو حل تجاري تصاعدالصورة لتجنب يتلاشى والتبريد من العينات.
  11. اختيار بعناية ساترة مع ملاقط غرامة ووضعه على حل المتصاعدة. تأكد من أن الجانب ساترة حيث تعلق الخلايا في اتصال مع الحل. ختم لل coverslips مع طلاء الأظافر وتحليلها باستخدام مضان أو المجهري متحد البؤر.

5. عزل الحمض النووي الريبي

  1. إعداد CD3 الأجسام المضادة ل(5 ميكروغرام / مل) مغلفة لوحات 96-جيدا. احتضان 4 × 10 4 ساذجة خلايا CD4 + T / جيد في 100 ميكرولتر من مستنبت تستكمل مع الأجسام المضادة CD28 المضادة (1 ميكروغرام / مل) لإكمال التحفيز. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 ل 0 إلى 72 ساعة.
  2. بعد مختلف الأوقات بعد تفعيل وضع الخلايا في أنبوب microcentrifuge.
  3. إضافة 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
  4. إزالة طاف وإضافة 1ML كاشف Trizol.
  5. احتضان لمدة 5 دقائق على RT والحفاظ على عينة -8076؛ مئوية لمدة لا تقل عن 24 ساعة. المضي قدما في عزل الحمض النووي الريبي عند الحاجة.
    ملاحظة: ترك العينة في -80 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 24 ساعة يحسن العائد الحمض النووي الريبي. أيضا، استخدام قفازات اليد أمر ضروري لتجنب تدهور الحمض النووي الريبي RNases.
  6. تذويب العينة الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة في حمام مائي.
  7. إضافة 200 ميكرولتر الكلوروفورم ويهز بقوة باليد لمدة 30 ثانية (لتجنب الخلط عدوانية من الحمض النووي الريبي قبل vortexing). احتضان 5 دقائق على RT.
  8. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 12000 x ج في 4 درجات مئوية.
  9. استرداد المرحلة المائية إلى أنبوب microcentrifuge جديد.
  10. إضافة 500 ميكرولتر الأيسوبروبانول وعكس أنبوب ثلاث مرات.
  11. احتضان 10 دقيقة في RT وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 12000 x ج في 4 درجات مئوية.
  12. تجاهل طاف بواسطة انقلاب.
  13. إضافة 1 مل من الجليد الباردة الايثانول 75٪ وأجهزة الطرد المركزي 10 دقيقة في 12000 x ج في 4 درجات مئوية.
  14. تماما تجاهل طاف وتجفيف بيليه RNA من خلال ترك الغطاء من أنبوب مفتوحة.
    ليسالبريد: عند هذه النقطة بيليه ليست واضحة للعيان. المتابعة على أية حال.
  15. Resuspend وبيليه في 20 ميكرولتر من الماء الصف الجزيئية. حساب التركيز والنقاء من الأحماض النووية عن طريق قياس 260 نانومتر و 280 نانومتر الامتصاصية باستخدام معمل NanoDrop.
  16. المضي قدما بحذر إلى توليف [كدنا باستخدام أي مجموعة الناسخ العكسي التقليدية وبعد بروتوكول manufacturer's.
    ملاحظة: يتم الحصول على حوالي 0،5-2 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي 4 × 10 4 خلايا CD4 + T ساذجة. [كدنا يمكن synthetized من 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبي واستخدامها في الوقت الحقيقي تفاعلات PCR دون الحاجة إلى مجموعات المدخلات المنخفضة الحمض النووي الريبي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بروتوكول وصفها في هذه المخطوطة يجعل نوعية جيدة من مثقف ويستريح الالتزام والسذاجة خلايا CD4 + T الإنسان المنشط (الشكل 1). تظهر خلايا CD4 + T تنشيط الشخصي التكاثري مميزة (الشكل 1B) بالمقارنة مع حالة الراحة (الشكل 1A). وCD25 أواخر تنشيط علامة مفيدة لتقييم تفعيل كفاءة في 72 ساعة لوحظ من قبل المجهر متحد البؤر (الشكل 1C). يتم استخدام علامة CD69 حاليا منصب مبكرة تنشيط علامة التدفق الخلوي أو المجهري. التزام الراحة وتنشيط خلايا CD4 + T ساذجة إلى ساترة المغلفة مع بولي-L-يسين مفيدة لدراسة التعبير وتوطين GD3 وTCR أظهر من وضع العلامات مزدوج مع المضادة GD3 والأجسام المضادة TCR المضادة (الشكل 2). كما ذكرنا سابقا، ويرافق التنشيط بواسطة إعادة تشكيلهاجي من GD3 وGD2 gangliosides في الخلايا السطحية 6. بالإضافة إلى ذلك، يتم تنفيذ الكمي التعبير الجيني للsynthases GD3 وGM2 / GD2 من 4 × 10 4 خلايا (الشكلان 2 و 3). لوحظ في التعبير الجدد من غانغليوزيد GD2 وTCR colocalization كاف بواسطة المجهر متحد البؤر، مما يدل على الدور المحتمل للGD2 في TCR تجميع أثناء التنشيط (الشكل 3). ويبين الشكل 4 توطين غانغليوزيد GD3 وGD2 الملون في وقت واحد في CD4 تفعيلها + خلايا تي. بالإضافة إلى ذلك، كانت ملطخة PBMCs تفعيلها مع مكافحة GD3 والأجسام المضادة GD2 تبين أن هذا البروتوكول يمكن استخدامها في السكان الخلايا المناعية الأخرى وجدت في PMBCs، ولا سيما GD2 التي وجدت لتكون المعبر عنها في جميع PMBCs المنشط (الشكل 5).

شكل 1
الشكل 1: تصور خلايا CD4 + T ساذجة بعد التزام وكفاءة تفعيل مكافحة CD3 / مكافحة CD28 (أ) الخلايا يستريح CD4 + T في 72 ساعة بعد تفعيل تعلق على بولي-L-يسين تعامل ساترة لوحظ من قبل brightfield. المجهر. (ب) المنشط خلايا CD4 + T في 72 ساعة تعلق على بولي-L-يسين تعامل ساترة. (ج) التعبير CD25 علامة (الحمراء)، وهويشت 333258 نوى الملون (الأزرق) من / مكافحة CD28 تنشيط الخلايا المضادة CD3 CD4 + T في 72 ساعة بعد التنشيط. شريط النطاق = 50 ميكرون. تم الحصول على الصور عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر مع الهدف النفط 60X S / 1.3 مع 2X تقريب رقمي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2 الشكل 2: GD3 غانغليوزيد وTCR وصمة عار والفحص المجهري التعريب في الراحة وتنشيط خلايا CD4 + T ساذجة في 72 ساعة بعد تفعيل خلايا يستريح CD4 + T مع (A) نواة ملطخة هويشت 333258، (ب) GD3 غانغليوزيد التوطين، (. ج) دمج نوى وGD3 غانغليوزيد. تنشيط خلايا CD4 + T مع (D) نواة ملطخة هويشت 333258، (E) GD3 غانغليوزيد التعريب و (F) دمج نوى وGD3 غانغليوزيد. (G) و (H) عرض TCR وGD3 غانغليوزيد في يستريح خلايا CD4 + T ساذجة. (J و K) يتوافق مع TCR وGD3 غانغليوزيد تلطيخ في خلايا CD4 + T تفعيلها. صور متحد البؤر TCR (الحمراء)، وGD3 غانغليوزيد (الأخضر) التعريب في يستريح خلايا CD4 + T ساذجة (I) ومكافحة CD3 / CD28 المنشط ساذجة خلايا CD4 + T 72 ساعة بعد تفعيل (L). تم تقييم GD3، TCR ونوى وصمة عار المجهري متحد البؤر من كومة واحدة مع 60X S / 1.3 هدف النفط مع 2X تقريب رقمي. (M) ويبين الرسم البياني التعبير الجيني للسينسيز GD3 يحددها في الوقت الحقيقي أعرب PCR مع تغير أضعاف من 4 × 10 4 يستريح (الراحة) وتنشيط (القانون) الساذجة خلايا CD4 + T في 72 ساعة بعد التنشيط. البيانات هي يعني ± SD من ثلاث جهات مانحة مستقلة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): GD2 غانغليوزيد وTCR وصمة عار وتوطين المجهري في الراحة وتنشيط خلايا CD4 + T ساذجة في 72 ساعة بعد التنشيط. + T مع (A) نواة ملطخة هويشت 333258، (ب) GD2 غانغليوزيد التوطين، (ج) دمج نوى وGD2 غانغليوزيد. تنشيط خلايا CD4 + T مع (D) نواة ملطخة هويشت 333258، (E) GD2 غانغليوزيد التعريب و (F) دمج نوى وGD2 غانغليوزيد. (G و H) عرض TCR وغانغليوزيد GD2 في يستريح خلايا CD4 + T ساذجة. (J و K) يتوافق مع TCR وGD2 غانغليوزيد تلطيخ في خلايا CD4 + T تفعيلها. صور متحد البؤر TCR (الحمراء)، وGD2 غانغليوزيد (الأخضر) توطين يستريح في خلايا ساذجة CD4 + T (I) ومكافحة CD3 / CD28 المنشط ساذجة خلايا CD4 + T 72 ساعة بعد تفعيل (L). تم تقييم GD2، TCR ونوى وصمة عار المجهري متحد البؤر من كومة واحدة مع60X الهدف النفط S / 1.3 مع 2X تقريب رقمي. (M) ويبين الرسم البياني التعبير الجيني للسينسيز GM2 / GD2 يحددها في الوقت الحقيقي أعرب PCR مع تغير أضعاف من 4 × 10 4 يستريح (الراحة) وتنشيط (القانون) الساذجة خلايا CD4 + T في 72 ساعة بعد التنشيط. البيانات هي يعني ± SD من ثلاث جهات مانحة مستقلة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
يظهر صمة عار مزدوجة مع مكافحة GD3 والأجسام المضادة لمكافحة GD2 لGD3 وGD2 gangliosides التعريب (A) GD3 غانغليوزيد تحديدها مع R24 مكافحة GD3 الأجسام المضادة في خلايا CD4 + T تفعيلها داخل الخلايا والأغشية الترجمة: الرقم 4. (ب) GD2 غانغليوزيد تحديدها مع 14G2الأجسام المضادة لمكافحة GD2 في خلايا CD4 + T تنشيط يظهر الوحيد غشاء البلازما توطين. (C) المجهري Brightfield من خلايا CD4 + T تفعيلها. تم تقييم وصمة عار GD3 وGD2 بواسطة المجهر متحد البؤر من كومة واحدة مع الهدف النفط 60X S / 1.3 مع 2X تقريب رقمي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5: GD3 وGD2 غانغليوزيد التعريب في PBMCs تنشيط تم الكشف عن (A) GD2 غانغليوزيد مع 14G2a مكافحة GD2 الأجسام المضادة في CD3 / CD28 72 ساعة تنشيط وظيفة PBMCs تراكب معادية مع brightfield المجهري، (ب) GD2 التعبير غانغليوزيد و (C ) GD2 غانغليوزيد ونوى دمج. (D) ganglios GD3IDE ملطخة R24 مكافحة GD3 الأجسام المضادة تراكب مع brightfield، (E) GD3 التعبير غانغليوزيد و (F) GD3 غانغليوزيد ونوى دمج. تم تقييم GD3، GD2 ونوى وصمة عار المجهري متحد البؤر من كومة واحدة مع 60X S / 1.3 هدف النفط مع 2X تقريب رقمي. شريط النطاق = 45 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بروتوكول صفها يمكن استخدامها لتوطين gangliosides أو البروتينات في تعليق خلية من خلايا CD4 + T أو الخلايا المناعية الأخرى (على سبيل المثال، PMBCs، الشكل 5) بدءا من عدد صغير من الخلايا. ونظرا لصغر حجم خلايا T وخصائص غير ملتصقة، واقتناء مضان الصور المجهرية النتائج إلى ضعف المعلومات أو جودة منخفضة إذا لم يتم التقيد الخلايا بشكل صحيح.

هذا البروتوكول جنبا إلى جنب مع تحليل نوعية جيدة متحد البؤر المجهري هو ميزة أساسية على استخدام تقنيات مثل اللوني طبقة رقيقة للكشف عن gangliosides لأنه يكشف توطين المكاني وديناميات gangliosides خلال فترة العلاج (على سبيل المثال، T تنشيط الخلايا)، مما أدى إلى اكتساب 11،12،13 البيانات ذات الصلة من الناحية البيولوجية. أيضا، يسمح هذا البروتوكول تقييم التعبير غانغليوزيد بدءا من عدد قليل من خلايا CD4 + T (2 × 10 4) يمكن أن يكون مفيدا لتحسين عدد مكررات أو فحوصات مختلفة 6.

علاج دقيق خلال يغسل وتلوين الأجسام المضادة بعد التصاق أمر بالغ الأهمية للحفاظ على عدد الخلايا والنزاهة. بسبب ضعف ملزمة للخلايا CD4 + T إلى ساترة، بل هو أيضا مهم جدا لإضافة بعناية وإزالة الحلول؛ خلاف ذلك انخفاض في عدد الخلايا وزيادة الحطام الفلورسنت سيتم اجهتها. عندما تقييمها من خلال الفحص المجهري متحد البؤر، والمناعية من gangliosides يمنح معلومات إضافية مثل توطين المكاني أو شارك في التعريب مع جزيئات أخرى في غشاء البلازما أو حجرات داخل الخلايا. يتطلب توطين التحت خلوية استخدام علامات التحت خلوية 14 و 15. وبالإضافة إلى ذلك، لا بد من استخدامها لتلطيخ عند تحديد التعبير غانغليوزيد يقتصر على سطح الخلية خلايا CD4 + T الطازجة وغير ثابتة. على الرغم من تثبيت من CD4 + T مLLS يساعد على الحفاظ على عينة لمدة 5 أيام على الأقل، لأنه يحمل مخاطر permeabilization وتلطيخ الخلايا.

ومع ذلك، ونظرا للتشابه هيكلي بين gangliosides، فمن المستحسن دائما أن تأخذ بعين الاعتبار خصوصية من الأجسام المضادة المستخدمة. العديد من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المضادة للغانغليوزيد المتاحة تجاريا يمكن استخدامها وبالنسبة للبعض منهم قد سبرت خصوصية بواسطة ELISA، TLC، الخ 16،17،18.

الأعمال السابقة تدل على أنه من الممكن الحصول على معلومات بشأن توطين والتعبير عن GD3 وGD2 gangliosides من 2 × 10 4 خلايا / في حالة 6. أيضا، يصف هذا البروتوكول القدرة على إجراء التجارب الجينات التنميط من 4 × 10 4 الخلايا، مما يسمح الأمثل لإسكات التجارب مثل تلك القائمة في جزيئات lentiviral 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced RPMI 1640  Thermo Fisher Scientific 12633-012 Suplemented with 3% FBS
mouse anti human CD3 antibody eBioscience 16-0037-81 OKT3 clone
mouse anti human CD28 antibody ebioscience 16-0288-81 CD28.6 clone
mouse anti human GD3  antibody Abcam ab11779 R24 clone
mouse anti human GD2 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-53831 14G2a clone
FITC-conjugated anti-mouse IgG3
antibody		 Abcam ab97259
Alexa Fluor 488 conjugated antimouse Thermo Fisher Scieni¡tific A-21131
IgG2a antibody
Alexa Fluor 647 conjugated antimouse Thermo Fisher Scieni¡tific A-21241
IgG2a antibody
Hoechst 333258 Sigma-Aldrich 861405
 Ficoll Paque-Plus GE 17-1440-02 
Trizol Reagent Invitrogen 15596-026
Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human MACS Miltenyi Biotec 130-094-131
BD FACSAria II BD Biosciences Sorting 
Nunc Lab-tek chamber slide system Sigma-Aldrich C7182
Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus)  Olympus Upright BX61WI and IX81 
Forward sequence primer GD3 synthase 5´-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3´ Ref. 7
Reverse sequence primer GD3 synthase 5´-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3´ Ref. 7
Forward sequence primer GM2/GD2 synthase 5´-CAACACAGCAGACACAGTCC-3´ Ref. 7
Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase 5´-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3´ Ref. 7

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mazzon, C., Viola, A. From tango to quadrilla: current views of the immunological synapse. Cell Adh Migr. 1 (1), 7-12 (2007).
  2. Hamann, D., Pa Baars,, Hooibrink, B., van Lier, R. W. Heterogeneity of the human CD4+ T-cell population: two distinct CD4+ T-cell subsets characterized by coexpression of CD45RA and CD45RO isoforms. Blood. 88 (9), 3513-3521 (1996).
  3. Zhong, L., Zhang, Z., Lu, X., Liu, S., Chen, C. Y., Chen, Z. W. NSOM / QD-Based Visualization of GM1 Serving as Platforms for TCR / CD3 Mediated T-Cell Activation. Biomed Res Int. , 276498 (2013).
  4. Nagafuku, M., Okuyama, K., et al. PNAS Plus: CD4 and CD8 T cells require different membrane gangliosides for activation. Procs Natl Acad Sci USA. 109 (6), E336-E342 (2012).
  5. Schnaar, R. L., Gerardy-Schahn, R., Hildebrandt, H. Sialic acids in the brain: gangliosides and polysialic acid in nervous system development, stability, disease, and regeneration. Physiol Rev. 94, 461-518 (2014).
  6. Villanueva-Cabello, T. M., Mollicone, R., Cruz-Muñoz, M. E., Lòpez-Guerrero, D. V., Martìnez-Duncker, I. Activation of human naïve Th cells increases surface expression of GD3 and induces neoexpression of GD2 that colocalize with TCR clusters. Glycobiology. 25 (12), 1454-1464 (2015).
  7. Müthing, J. TLC in structure and recognition studies of glycosphingolipids. Methods Mol Biol. 76 (17), 183-195 (1998).
  8. de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).
  9. O'Neil-Andersen, N. J., Lawrence, D. A. Differential modulation of surface and intracellular protein expression by T cells after stimulation in the presence of monensin or brefeldin A. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (2), 243-250 (2002).
  10. Mannering, S. I., Zhong, J., Cheers, C. T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection. Immunology. 106 (1), 87-95 (2002).
  11. Marconi, S., Acler, M., et al. Anti-GD2-like IgM autoreactivity in multiple sclerosis patients. Mult Scler. 12 (3), 302-308 (2006).
  12. Park, J. E., Wu, D. Y., et al. Fine specificity of natural killer T cells against GD3 ganglioside and identification of GM3 as an inhibitory natural killer T-cell ligand. Immunology. 123 (1), 145-155 (2008).
  13. Simon, B. M., Malisan, F., Testi, R., Nicotera, P., Leist, M. Disialoganglioside GD3 is released by microglia and induces oligodendrocyte apoptosis. Cell Death Differ. 9 (7), 758-767 (2002).
  14. Beske, O., Reichelt, M., Taylor, M. P., Kirkegaard, K., Andino, R. Poliovirus infection blocks ERGIC-to-Golgi trafficking and induces microtubule-dependent disruption of the Golgi complex. J Cell Sci. 120 (18), 3207-3218 (2007).
  15. Zuber, C., Spiro, M. J., Guhl, B., Spiro, R. G., Roth, J. Golgi apparatus immunolocalization of endomannosidase suggests post-endoplasmic reticulum glucose trimming: implications for quality control. Mol Biol Cell. 11 (12), 4227-4240 (2000).
  16. Yamashiro, S., Okada, M., et al. Expression of (GD3 synthase) gene in human cancer cell lines: high level expression in melanomas and up-regulation in activated T lymphocytes. Glycoconj J. 12 (6), 894-900 (1995).
  17. Wipfler, D., Srinivasan, G. V., et al. Differentially regulated expression of 9-O-acetyl GD3 (CD60b) and 7-O-acetyl-GD3 (CD60c) during differentiation and maturation of human T and B lymphocytes. Glycobiology. 21 (9), 1161-1172 (2011).
  18. Pukel, C. S., Lloyd, K. O., Travassos, L. R., Dippold, W. G., Oettgen, H. F., Old, L. J. GD3, a prominent ganglioside of human melanoma. Detection and characterisation by mouse monoclonal antibody. J Exp Med. 155 (4), 1133-1147 (1982).

Tags

علم المناعة، العدد 117، الإنسان، CD4 + T الخلية، التنشيط، الأجسام المضادة، gangliosides، TCR، التعريب، الفحص المجهري متحد البؤر، والتقيد
إعداد CD4<sup&gt; +</sup&gt; خلايا T للتحليل GD3 وGD2 غانغليوزيد غشاء التعبير بواسطة الميكروسكوب
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Villanueva-Cabello, T. M.,… More

Villanueva-Cabello, T. M., Martinez-Duncker, I. Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy. J. Vis. Exp. (117), e54569, doi:10.3791/54569 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter