Wir präsentieren detaillierte Protokolle für die Isolierung von Aorten aus der Maus und die Messung ihres Elastizitätsmoduls mittels Rasterkraftmikroskopie.
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In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Arterielle Versteifung ist ein signifikanter Risikofaktor und Biomarker für Herz-Kreislauf-Erkrankungen und ein Markenzeichen des Alterns. Rasterkraftmikroskopie (AFM) ist ein vielseitiges Analysewerkzeug für viskoelastische mechanischen Eigenschaften für eine Vielzahl von Materialien zu charakterisieren die von harten (Kunststoff, Glas, Metall, etc.) Oberflächen auf Zellen , die auf jedem Untergrund. Es wurde in großem Umfang verwendet, um die Steifigkeit der Zellen zu messen, aber weniger häufig verwendet, um die Steifigkeit des Aorten messen. In diesem Beitrag werden wir die Verfahren für die Verwendung von AFM im Kontaktmodus beschreiben die ex vivo - Elastizitätsmodul von unbelastetem Maus Arterien zu messen. Wir beschreiben unsere Verfahren zur Isolierung von Maus Aorten und dann detaillierte Informationen für die AFM-Analyse liefern. Dazu gehören die Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Ausrichtung des Laserstrahls eine Kalibrierung der Federkonstante und Ablenkung Empfindlichkeit der AFM-Sonde, und den Erwerb von Kraftkurven. Wir bieten auch ein detailliertes Protokoll für die Daten Analysis der Kraftkurven.
Einleitung
Die biomechanischen Eigenschaften von Arterien sind eine entscheidende Determinante für Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) und das Altern. Die arterielle Steifigkeit, ein wichtiger cholesterinunabhängiger Risikofaktor und ein Indikator für das Fortschreiten von Herz-Kreislauf-Erkrankungen, nimmt mit Gefäßverletzungen, Arteriosklerose, Alter und Diabeteszu 1-8. Die Versteifung der arteriellen Wand ist mit einer erhöhten Dedifferenzierung, Migration und Proliferation von glatten Gefäßmuskelzellen verbunden9-12. Darüber hinaus wurde eine erhöhte arterielle Steifigkeit mit einer verbesserten Makrophagenadhäsion1, einer endothelialen Permeab....
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Protokoll
Tier Arbeit in dieser Studie wurde von den Institutional Animal Care und Verwenden Ausschüssen der University of Pennsylvania genehmigt. Die Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den genehmigten Richtlinien durchgeführt.
1. Vorbereiten der Maus und Isolierung der Aorta
- Anästhesieren eine Maus mit Ketamin (80 - 100 mg / kg), Xylazin (8 - 10 mg / kg) und Acepromazin (1 - 2 mg / kg) intraperitoneal. Bestätigen Anästhesie mit einem Schwanz Kneiftest. Sobald die Maus vollständig betäubt, einschläfern die Maus durch Genickbruch.
- Platzieren Sie die Maus auf den Rücken und Pin mit der Maus auf eine Dissektion Bord. Reinigen....
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Ergebnisse
5A zeigt ein Phasenkontrastbild des absteigenden (Thorax) Aorta aus einem 6-Monate alten, männlichen C57BL / 6 - Maus. Die AFM - Cantilever ist an Ort und Stelle direkt über dem Gewebe und bereit für den Einzug. 5B und 5C zeigen repräsentative Kraftkurven durch AFM Vertiefung im Kontaktmodus erhalten. Grüne Linien in den 5B und 5C gezeigt stellen die besten Fitkurven für eine Kugel mit dem Hertzian Modell erhalten. In 5D
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Diskussion
AFM Einbuchtung kann verwendet werden, um die Steifigkeit (Elastizitätsmodul) von Zellen und Geweben zu charakterisieren. In diesem Beitrag stellen wir ausführliche Schritt- für -Schritt - Protokolle , um die absteigende Aorta und Aortenbogen in der Maus und bestimmen die Elastizitätsmoduli dieser arteriellen Regionen ex vivo zu isolieren. Wir haben jetzt zusammenfassen und die technischen Probleme und Einschränkungen des Verfahrens in diesem Papier beschrieben diskutieren.
Verschie.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Die AFM-Analyse wurde mit Hilfe des Pennsylvania Muscle Institute und des Institute for Translational Medicine and Therapeutics, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, durchgeführt. Diese Arbeit wurde durch NIH-Zuschüsse HL62250 und AG047373 unterstützt. YHB wurde durch ein Postdoktorandenstipendium der American Heart Association unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| BioScope Catalyst AFM-System | Bruker | ||
| Nikon Eclipse TE 200 inverses Mikroskop | Nikon Instruments | ||
| Siliziumnitrid-AFM-Sonde | Novascan Technologies | PT. SI02. SN.1 | 0,06 N/m Ausleger; 1 & Mikro; m SiO2 Partikel |
| Dumont #5 Pinzette | Fine Science Tools | 11251-10 | Siehe Abschnitt 1.4 |
| Dumont #5SF Pinzette | Fine Science Tools | 11252-00 | Siehe Abschnitt 1.8 |
| Feine Schere-ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | Siehe Abschnitt 1.4 (mittelgroß) |
| Vannas-Tü Bingen Federschere | Fine Science Tools | 15008-08 | Siehe Abschnitt 1.6 (kleine Größe) |
| 60 mm TC-behandelte Zellkulturschale | Corning | 353004 | |
| Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 1x | Corning | 21-031-CM | Ohne Calcium und Magnesium |
| Krazy Glue Instant Allzweckflüssigkeit | Krazy Glue | KG58548R | Siehe Abschnitt 2.2 |
| Gel-Ladespitzen, 1 - 200 & Mikro; l | Fisher | 02-707-139 | Siehe Abschnitt 2.2 |
| Pinzette für | Elektronenmikroskopie | 78092-CP | Siehe Abschnitt 3.2 |
| 50-mm-Glasbodenschalen mit klarer Wand | TED PELLA | 14027-20 | Siehe Abschnitt 4.4 |
Referenzen
- Kothapalli, D., et al. Cardiovascular Protection by ApoE and ApoE-HDL Linked to Suppression of ECM Gene Expression and Arterial Stiffening. Cell Rep. 2, 1259-1271 (2012).
- Liu, S. -L., et al. Matrix me....
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Nachdrucke und Genehmigungen
