Abstract
الانحرافات عن المستويات الطبيعية وأنماط القص لعب أدوارا هامة السوائل الأوعية الدموية في علم وظائف الأعضاء الأوعية الدموية والفيزيولوجيا المرضية عن طريق إحداث التكيف فضلا عن التغيرات المرضية في النمط الظاهري البطانية والتعبير الجيني. على وجه الخصوص، يمكن أن آثار غير القادرة على التأقلم من الدوري، وتدفق في اتجاه وإجهاد القص الناجمة تؤدي مجموعة متنوعة من الآثار في العديد من أنواع الخلايا الأوعية الدموية، وخاصة الخلايا البطانية. بينما الآن كانت الخلايا البطانية من أصول التشريحية المختلفة مثقف، تحليلات متعمقة من تعرقلت ردودها على القص السوائل عن طريق تعقيد النسبي للنماذج القص (على سبيل المثال، وبالتوازي مع غرفة التدفق لوحة، والمخروط ونموذج التدفق لوحة). في حين أن هذه تمثل كلها أساليب ممتازة ومثل هذه النماذج معقدة من الناحية الفنية وتعاني من عيوب بما في ذلك وقت الإعداد طويلة ومعقدة نسبيا، والمناطق السطحية منخفضة، ومتطلبات المضخات والضغط تتطلب المواد المانعة للتسرب وحشيات في كثير من الأحيان، وخلق تحديات بوتصيانة ح من العقم وعدم القدرة على تشغيل تجارب متعددة. ومع ذلك، إذا كانت نماذج ارتفاع الناتج من تدفق والقص المتاحة، مزيد من التقدم على الردود القص بطانة الأوعية الدموية، والبحوث القص الدوري وخصوصا على المستوى الجزيئي، قد يكون أكثر تقدما سريعا. هنا، نحن تصف بناء واستخدام حلقات القص: رواية، بسيطة إلى التجمع، وغير مكلفة نموذج زراعة الأنسجة مع مساحة كبيرة نسبيا الذي يسمح بسهولة لعدد كبير من مكررات التجريبية في، القص الدوري الدراسات الضغط أحادي الاتجاه على الخلايا البطانية.
Introduction
وقد تبين إجهاد القص السوائل لتعديل برامج الجين البطانية 1-5 من خلال تفعيل عناصر رابطة الدول المستقلة التنظيمية 6، هيستون النشاط أسيتيل 7 و عناصر الاستجابة للضغط النفسي القص (SSRE) 8. القص تأثيرات الإجهاد المساهمات البطانية نحو تجلط الدم عن طريق تحوير العامل النسيجي 9 و منشط البلازمينوجين النسيجي (TPA) 10 التعبير. يؤثر إجهاد القص أيضا السيطرة على الأوعية الدموية 11 وإعادة السفينة التي تنظم تخليق PDGF-B والاستجابة 8. البطانية مشتقة سطاء فعال في الأوعية adrenomedullin، endothelin-1، وينظم urotensin الثاني والريلاكسين أيضا القص 12. النسخ من البطانية النيتريك إنتاج أكسيد سينسيز وإنتاج أكسيد النيتريك على حد سواء القص يعتمد 10. كما تسيطر القص البطانية ICAM-1 التعبير 13. القص الإجهاد الناجم عن التدفق وبالتالي يمكن powerfuالتأثير LLY مجموعة كبيرة ومتنوعة من الاستجابات البطانية. الأهم من ذلك، نبضات الأوعية الدموية الآن تظهر أيضا أن تلعب أدوارا هامة في الفيزيولوجيا المرضية لكلا شيخوخة الأوعية الدموية الطبيعية وأشكال الخرف الوعائي 14 ويمكن أن تسهم حتى الأمراض العصبية الأخرى، مثل التصلب المتعدد 15.
وكشفت الوريدية والشريانية الخلايا البطانية بطبيعتها إلى أنماط تدفق الدورة الدموية المختلفة في الجسم الحي، والعديد من مختلف الظواهر الخلايا البطانية يمكن أظهرت 16. اعتمادا على حجم ووتيرة تدفق، ويمكن أن تشمل التأثيرات على الخلايا البطانية تنشيط الخلايا الالتهابية وموت الخلايا المبرمج، والتي قد تعكس التغيرات في الجينات أو البروتين التعبير 17،18. دراسات عن مدى استجابة الخلايا البطانية للقص الظواهر بالتالي تبقى معقدة من جراء الصعوبات في إنتاج نماذج في المختبر التي تنتج بشكل كاف مثل هذه الأنماط القص.
العديد من experime مختلفةوقد وضعت بروتوكولات ntal لتطبيق إجهاد القص السائل إلى البطانية الطبقات الوحيدة الخلية. أحد أنظمة الأكثر شيوعا هي موازية غرفة التدفق لوحة، مما يخلق تدفق الصفحي موحد داخل غرفة 19-21. وعادة ما يتم توصيل مضخة تحوي لخلق تدفق الدوري، والتي يمكن تلخيص خصائص التدفقات التي توجد عادة في العديد من المواقع في الجسم الحي 22. يستخدم المشترك انشاء أخرى في "مخروط ولوحة" نموذج، حيث يتم تحديد إجهاد القص السوائل عن طريق سرعة دوران مخروط 23. كلا النظامين، وترتيبات أخرى مشابهة لها، ويمكن أن تكون مملة لانشاء وتتطلب المكونات التي يمكن أن تكون مكلفة نسبيا وبعيدة عن متناول العديد من المختبرات.
قيدا رئيسيا آخر من هذه النماذج الحالية هو عدد قليل نسبيا من الدراسات تكرار التي يمكن القيام بها في وقت واحد، ولكل منها مساحة منخفضة نسبيا. وهذا يزيد من الوقت والتعاون mplexity هذه النهج. لذلك، وهو نموذج مثالي أن يدفع القص أحادي الاتجاه والدوري قد يكون واحدا حيث عدد كبير من مكررات الدراسة يمكن تعيين ما يصل بسهولة، ولكل منها مساحة كبيرة نسبيا. وعلاوة على ذلك، فإن النماذج المذكورة أعلاه تتطلب الإعداد متطورة إلى حد ما، والتي قد تكون باهظة التكلفة بالنسبة لكثير من المستخدمين. نموذج التي يمكن أن تنتج اضطرابات القص السوائل باستخدام المواد المختبرية الأساسية قد يكون العديد من المزايا.
وهناك طريقة بسيطة واقتصادية للغاية تطبيق أحادي الاتجاه، إجهاد القص الدوري ينطوي على وضع أطباق دائرية على شاكر المداري 24. هذا البروتوكول هو بسيط جدا ويمكن زيادتها إلى تحقيق أرقام عالية من الدراسة يعيد، ولكل منها مساحة كبيرة نسبيا، حسب الحاجة. ومع ذلك، تتعرض الخلايا تقع في وسط الطبق لأنماط التدفق مختلفة من الخلايا على امتداد المحيط الخارجي، مما أسفر عن ردود المظهرية الخلوية مختلطة في نفس الطبق.
_content "> في هذا التقرير الحالي، نحن تصف بناء واستخدام" حلقات القص، لدينا نموذج لخلق إجهاد القص أحادي الاتجاه والدوري، وتصميم لحلقة القص بشكل فعال حدود "مختلطة" الظواهر التي يسببها القص الخلوية عن طريق تقييد تدفق المسار داخل طبق ثقافة التعميم إلى المحيط من خلال وضع الحلقة الداخلية، وبناء وتشغيل الحلقة القص هو بسيط واقتصادي ويمكن زيادتها بسهولة لاستيعاب مجموعة واسعة من الهزازات المدارية باستخدام المتاحة على نطاق واسع لوازم زراعة الأنسجة. هذا نموذج يمكن تطبيقه في تجارب الخلايا البطانية لتوفير أنماط تدفق أحادي الاتجاه والدورية ضمن مستويات الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. بناء 150 مم القطر القص خواتم (الشكل 1)
قد يتم بناؤها حلقات القص لخلق أبعاد كثيرة مختلفة متفاوتة الأحجام طبق بيتري الخارجي والداخلي، مما أدى إلى الأجهزة مع مختلف مجموع المساحات السطحية، والمحاصيل الخلية وضعت نطاقات قوى القص: ملاحظة. ويصف هذا التقرير طبق 150 ملم جنبا إلى جنب مع طبق الداخلي 100 مم لمساحة إجمالية قدرها 98 سم 2 (الشكل 2).
الشكل 1. القص عصابة التجمع، والجزء العلوي من هذا الرقم يظهر حلقة القص تجميعها جزئيا. ضخ 0.5 مل من كلوريد الميثيلين من خلال ثقب 3 ملم مع الماصة نقل إذا ختم ضيق لم شكلت تماما بين الأطباق الداخلية والخارجية. وختم الحلقة القص اغلاق طريق تطبيق حبة سميكة 1 ملم من مادة لاصقة السيليكون والمطاط حول EDG الداخلي(ه) من رأس عصابة القص. الجزء السفلي من هذا الرقم يدل على عصابة القص تجميعها. يمثل اللون الأزرق مجال الخلايا البطانية مطلي. السهام الحمراء الخارجي والداخلي وتشير الحركة المدارية للحلقة القص وسائل الإعلام داخل الحلبة القص عند وضعه على شاكر المداري. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. القياسات السطحية لحلقة القص 150 ملم (وليس رسمها لتوسيع نطاق). وتظهر لوحة أعلى التحول الطرد المركزي من السوائل نحو الطوق الخارجي ردا على دوران مداري. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- إنشاء قالب بناء حلقة القص عن طريق توليد150 ملم الشخصي الحافة الخارجية في برنامج العرض التي يبلغ قطرها الداخلي 100 ملم وضعت في مركز الدائرة 150 ملم. طباعة القالب على ورقة A4 ورقة بيضاء.
- الماصة 10 مل من كلوريد الميثيلين (ثنائي كلورو ميثان) إلى 150 ملم الزجاج طبق بيتري. ومن الأهمية بمكان أن الطبق الزجاجي وليس البوليسترين (أو غيرها من البلاستيك الفينيل)، وكلوريد الميثيلين solubilizes معظم المواد البلاستيكية وتستخدم هنا للانضمام المكونات البلاستيكية.
تنبيه: استخدام قفازات لجميع البناء مع التهوية هود كافية. كلوريد الميثيلين هو مهيج الاتصال وغير سامة للكبد. - محاذاة 150 ملم البلاستيك طبق بيتري على قالب حلقة القص الخارجي.
- حفر حفرة 3 مم في وسط صحن 100 ملم باستخدام أداة دوارة. إزالة أي نجارة البلاستيك الناتجة من الحفر.
- في حين عقد مع يد القفاز، عكس وتراجع الحافة العلوية للطبق 100 ملم بيتري من الخطوة السابقة في بركة من كلوريد الميثيلين لحوالي 3 ثانية.
- عبرفر من "المبللة" 100 ملم طبق حافة إلى أسفل على مركز طبق 150 ملم، والتوفيق بعناية طبق 100 ملم على القالب ملحوظ. وكلوريد الميثيلين الصمامات البلاستيك، والانضمام إلى الأطباق 100 ملم و 150 ملم. تناوب بلطف الطبق في اتجاه عقارب الساعة 100 ملم وعكس عدة مرات لضمان التصاق جيدة على طبق 150 ملم.
ملاحظة: خذ بعناية كبيرة لضمان التوافق السليم للطبق الداخلي إلى وسط الطبق الخارجي. قد يؤدي محاذاة غريب الأطوار في أشكال مختلفة من إجهاد القص في مواقع مختلفة في الحلقة القص. الحرص على عدم السماح كلوريد الميثيلين أن يتقطر عن طريق الخطأ على جزء المسار الخارجي للطبق بيتري 150 ملم خلال وضع الطبق 100 ملم. وهذا إذابة البلاستيك على السطح السفلي حيث الخلايا سوف تنمو، وخلق سطح متفاوتة التي قد تسبب اضطرابات تدفق. - مرة واحدة قد جفت كلوريد الميثيلين، والوجه أطباق بتري ملزمة حديثا على وتفتيشها بدقة نقاط الاتصال للتأكد من أنوقد تم تشكيل لختم ضيق بين اثنين من أطباق بتري.
- إذا ختم ضيق لم شكلت تماما، حقن 0.5 مل من كلوريد الميثيلين من خلال ثقب 3 ملم مع الماصة نقل. التقط صحن وتناوب بلطف على السماح كلوريد الميثيلين للوصول إلى الحافة.
ملاحظة: إذا استدارة بسرعة كبيرة جدا، ويمكن أن كلوريد الميثيلين تمتد إلى الجزء الخارجي للصحن 150 ملم، تشويه السطح حيث سوف تنمو الخلايا وتدمير عصابة القص. يجب التخلص من تسرب حلقات القص. - اغلاق ثقب في طبق 100 ملم عن طريق تطبيق حبة 3 ملم من تسرب السيليكون والمطاط.
- باستخدام أداة دوارة مزودة قطع الرأس مسطح، وقطع سم الجزء العلوي 3 من أنبوب زراعة الأنسجة البوليسترين 15 مل مخروطي الشكل، وترك 1 سم على الأقل من الأنبوب تحت الغطاء. تلميع حافة أنبوب قطع حتى تصبح ناعمة ومسطحة استخدام الجانب المسطح من قطع الرأس. إزالة أي نجارة البلاستيك التي تنتجها طحن.
- تتبع قطع أنبوب مخروطي 15 مل علىغطاء للطبق 150 ملم مع علامة، حوالي 0.5 سم بعيدا عن حافة الطبق. حفر حفرة داخل دائرة مرسومة، وترك هامش حوالي 1-2 ملم من على حافة الدائرة.
- ضع قطع رأس أنبوب مخروطي على حفر حفرة. باستخدام الماصة نقل، وتطبيق ما يقرب من 250 ميكرولتر من كلوريد الميثيلين لقطع حواف أنبوب مخروطي لربط أنبوب مخروطي إلى غطاء 150 مم.
- ختم غطاء 150 ملم على طبق 150 ملم عن طريق تطبيق حبة سميكة 1 ملم من تسرب السليكون المطاط حول الحافة الداخلية من كبار طبق بيتري.
2. تعقيم خواتم القص
- الماصة حوالي 10 مل من الفوسفات مخزنة المالحة في حلقة القص شكلت حديثا من خلال 15 مل ميناء أنبوب مخروطي الشكل. تحوم حول لإزالة أي حطام داخل الحلبة القص. إزالة الفوسفات مخزنة المالحة مع الماصة باستور / فراغ الشافطة.
- تكرار الخطوة السابقة حتى تتم إزالة الحطام.
- لستيريليز الحلقة القص، واستخدام مزيج من شطف الايثانول 70٪ مع الأشعة فوق البنفسجية.
- فك تنفيس كأب، والماصة حوالي 10 مل من الايثانول 70٪ عن طريق ميناء الوصول، والمسمار الغطاء مرة أخرى. وتناوب على الوجه الدائري القص عدة مرات، وضمان أن داخل الحلبة القص وغسلها جيدا.
- تحت غطاء الدخان، نضح من فائض 70٪ من الإيثانول. مع زجاجة رذاذ، رذاذ دقيق للسقف وميناء الوصول مع 70٪ من الإيثانول.
- ضع الحلقة القص والحد الأقصى تحت الأشعة فوق البنفسجية داخل غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة حتى تجف تماما.
- مرة واحدة جافة، المسمار الغطاء الخلفي على وتخزين تعقيم حلقات القص في درجة حرارة الغرفة حتى تستخدم في الطلاء ثقافة الخلية.
3. دراسات إجهاد القص
- لوحة الخلايا البطانية في حلقات القص تعقيمها بعد بروتوكول زراعة الخلايا القياسية وعادة ما تستخدم نسبة 1: 4 انقسام لخطوط الخلايا البطانية تحويلها.
ملاحظة: الجرذ microv شبكية العينوقد تم الحصول على الخلايا البطانية ascular تجاريا. وقدمت الخلايا البطانية الدماغ البشري (hCMEC / D3) خلايا كهدية سخية من الدكتور بيير أوليفر Couraud (INSERM، فرنسا)، وكان المثقف في كامل المتوسطة القاعدية البطانية (EBM). - السماح للثقافات للوصول إلى نقطة التقاء قبل الشروع في دراسات التدفق. استخدام 30 مل من وسائل الاعلام زراعة الأنسجة (10٪ مصل العجل الجنين والمتوسطة تعديل النسر Dulbecco ومع 1٪ البنسلين / الستربتومايسين / أمفوتيريسين). تغيير مستنبت خلايا كل 3 أيام، والحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 7.5٪ CO 2 و 92.5٪ للهواء الغرفة.
- ضع شاكر المداري في الحاضنة.
ملاحظة: الهزازات المداري هي ثقيلة عادة (> 10 كلغ). ضع شاكر المداري على الرف السفلي من الحاضنة للحد من التوتر الرف والاهتزاز. - وضع حلقات القص التجريبية على شاكر المداري. وضع ثابت حلقات المجموعة الضابطة القص داخل نفس الحاضنة.
- تقدير الحد الأقصى لإجهاد القص داخل شحلقة الأذن مع المعادلة
أين 
هو نصف قطر دوران شاكر المداري (في سم)، 
هي لزوجة متوسطة (في اتزان)، 
هي كثافة متوسطة (جم / مل)، و 
هو تواتر التناوب (في دوران / ثانية) 24. - بدء الإعداد التناوب على شاكر المداري إلى دورة في الدقيقة المطلوبة (على سبيل المثال، 90 دورة في الدقيقة)، وترك حلقات القص على شاكر لمدة المرجوة من تطبيق إجهاد القص (على سبيل المثال، 72 ساعة).
ملاحظة: يمكن الهزازات المدارية إنتاج الحرارة، لذلك يجب مراقبة درجة حرارة الحاضنة في البداية لضمان الحفاظ على 37 درجة مئوية طوال مدة التجربة. بدلا من ذلك، قيمكن نقل حلقات نسمع إلى غرف البيئية (على سبيل المثال، وحدات غرفة الحاضنة) ومن ثم وضعها في حاضنة الدورية. - بعد أن يكونوا قد تعرضوا طبقات الخلايا القص لمدة من الوقت المطلوب، وإزالة حلقات القص من الحاضنة. سحب قبالة غطاء حلقة القص واسترداد خلايا و / أو وسائل الإعلام لفحص نقطة النهاية المرجوة يحلل (على سبيل المثال، النشاف الغربي، مضان تنشيط الخلايا الفرز، وما إلى ذلك) 25.
أين Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هنا نقدم نتائج ممثل من كل من hCMEC / D3 الخلايا البطانية الدماغ وشبكية العين الفئران الطبقات الوحيدة الخلية الاوعية الدموية الدقيقة البطانية، مثقف في حلقات القص.
بعد السماح hCMEC / D3 الطبقات الوحيدة الخلية البطانية الدماغ ليصل إلى نقطة التقاء في EBM كاملة، وضعت حلقات القص على شاكر المداري لمدة 72 ساعة. باستخدام المعادلة من الخطوة 3.5، تحسب إجهاد القص القصوى 
وكان ما يقرب من 2.8 داين / سم 2 (مع المعلمات 
= 0.95 سم، 
= 0.0101 اتزان، 
= 0.9973 جم / مل 24، 
= 1.5 تناوب / ثانية ). لقد وجدنا أن هذه الطبقات الوحيدة الخلية البطانية تظهر أحيانا محاذاة بالتوازي مع اتجاه تدفق الدوري (الشكل 3)، على الرغم من أن هذا لم يلاحظ بشكل موحد لطبقات الخلايا وعادة ما يكون التصاق ممتازة لسطح حلقة القص طوال فترة الدراسة.
بعد السماح الفئران الشبكية الاوعية الدموية الدقيقة الطبقات الوحيدة الخلية البطانية ليصل إلى نقطة التقاء في كامل المتوسطة الخلايا البطانية الفئران، بما في ذلك EGF / VEGF المكملات عامل النمو، وضعت حلقات القص على شاكر المداري لمدة 72 ساعة. باستخدام المعادلة من الخطوة 3.5، تحسب إجهاد القص القصوى وكان ما يقرب من 12 داين / سم 2 (مع المعلمات = 0.95 سم، = 0.0101 اتزان،ديزيل / ftp_upload / 54632 / 54632eq4.jpg "/> = 0.9973 جم / مل 24، = 4 دورات / الثانية). ويبين الشكل (4) أن مقارنة بالمجموعة الضابطة تحميل β-الأكتين، كان هناك خسارة كبيرة وهامة من الصفائح الدموية البطانية جزيء التصاق الخلية (PECAM 1 / CD31) من على سطح الخلايا البطانية.
PECAM-1 هو بروتين الغشاء لا يتجزأ وهو عضو في الغلوبولين المناعي (IG) -superfamily يحتوي على immunoreceptor تعتمد على التيروزين عزر المثبطة أو "ايتيم" 26. لا يتم التعبير عن PECAM-1 فقط على الخلايا البطانية ولكن تم العثور أيضا على الخلايا المكونة للدم. يلعب PECAM-1 أدوارا هامة في بطانة الأوعية الدموية التصاق الخلية خلية، الكريات البيض موصلي التهجير، الإشارات الخلوية، والأهم من ذلك، والميكانيكية تنبيغ إجهاد القص. دور PECAM-1 في الاستشعار عن إجهاد القص هو أمر حاسم لوظائف الأوعية الدموية endotheli خلايا القاعدة والتوازن 17. عندما تتعرض الطبقات الوحيدة البطانية لإجهاد القص، PECAM-1 يستجيب مباشرة للقوة الميكانيكية المبذولة على ذلك عن طريق تغيير الفسفرة التيروزين لها، وتفعيل لاحقة من ERK1 / 2 يشير شلال 27. وعلاوة على ذلك، تمت مقاطعة PECAM-1-أنوش جمعية المعقدة التي الاضطرابات في إجهاد القص 28. لذلك، PECAM-1 تمكن خلايا بطانة الأوعية الدموية لاستشعار التغيرات في القوات إجهاد القص السوائل التي يمكن أن تؤدي إلى تمدد رد الفعل من جدار الوعاء الدموي 29.
وتدعم هذه البيانات هذا النموذج تبين أن الخلايا البطانية تستجيب للتعرض للالدوري، القص السوائل أحادي الاتجاه من أسفل تنظيم وموصلي هاما وحاسما لاصق، التي تتوسط الاتصال بين الخلايا وكذلك تبادل خلية transvascular.
632fig3.jpg "/>
الشكل 3. الدماغ مورفولوجيا الخلايا البطانية في حلقة القص، وظهور الطبقات الوحيدة الخلية hCMEC / D3endothelial في حلقات القص بعد 48 ساعة من القص السوائل الدوري أو التعرض ثابت. المواءمة بين الثقافات ليست دائما وحظ بالتوازي مع تدفق الاتجاه (كما هو موضح بواسطة السهم). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. ردود خلية إلى القص الدوري. الجرذ الاوعية الدموية الدقيقة في شبكية العين الطبقات الوحيدة الخلية البطانية مثقف في حلقات القص أظهرت انخفاضا في PECAM1 / CD31 بالنسبة لبيتا الأكتين (ن = 3 لكل منهما، طلاب أونبايريد اختبار (ت)، * -p <0.05، أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري)، بعد 72 ساعة من الشيا السائل الدوري(ص) في حلقات القص.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بناء على نظام عصابة القص لتعريض الخلايا البطانية القص هو نهج بسيط لإجراء الدراسات إجهاد القص. ومع ذلك، هناك بعض الخطوات التي تعتبر بالغة الأهمية للحصول على حلقات القص العالية ونتائج أفضل. وينبغي بذل ختم كاملة بين الحلبة الداخلية والخارجية لمنع وسائل الإعلام من تسريب التي يمكن أن تؤدي إلى إجهاد القص غير متناسقة بين العينات. إذا لم يتم ختم كامل، يجب إضافة كمية صغيرة من كلوريد الميثيلين إلى الحافة بين الطبق الداخلي والخارجي مع الماصة نقل من خلال ثقب في الحلقة الداخلية. بلطف الدورية للحلقة ينبغي أن يسمح لكلوريد الميثيلين لتشكيل ختم كاملة. أيضا، نجارة البلاستيكية المنتجة عن غير قصد من القطع قد تكون موجودة على الطريق الدائري القص، لذلك الشطف خارج الحلبة القص بعد البناء يجب إزالة أي حطام التي يمكن أن تؤثر سلبا على نمو الخلايا وإعطاء يتعارض تطبيق إجهاد القص.
لياليحلقات نسمع الموضحة في مقالة كبيرة الحجم نسبيا، مما أدى إلى ارتفاع حجم الناتج لكل عينة. ومع ذلك، إصدارات أصغر يمكن بناؤها باستخدام أطباق بتري أصغر (على سبيل المثال، 100 مم طبق بيتري مع ادخال 60 ملم). بناء حلقات متعددة القص أصغر يمكن أن تسمح لأعداد أكبر من يعيد دراسة في حين لا يزال الحفاظ على كميات السوائل الكبيرة نسبيا والمناطق السطحية في العينة بالمقارنة مع الطرق الأخرى.
وقد لاحظت وقضايا قليلة عند استخدام حلقات القص. أولا، بعض الهزازات المدارية تنتج كميات زائدة من الحرارة، وتفشل بعض حاضنات للسيطرة على هذه الزيادة في درجة الحرارة. ويمكن تجنب ذلك عن طريق اختيار المناسب من الدوارات واستخدام حاضنات تغلف غير المياه، التي تبادل الحرارة أكثر من ذلك بكثير بسهولة. تلوث الثقافة هو قلق محتمل آخر عند استخدام حلقات القص، خصوصا بعد التجمع في بيئة الهواء الطلق. حلقات القص يجب تعقيمها جيدا قبل الاستعمال.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ج يني يون لديه منحة بحثية من مؤسسة أنيت Funicello. J. ستيفن الكسندر لديها دعم البحوث من قسم علم الأعصاب، LSUHSC-S.
Acknowledgments
فإن الكتاب أن نعترف المساعدة من السيد كريستوفر نغوين، هارون هنتر وويزيانا في Jumpstart، سمارت، وبرامج التدريب Biostart فضلا عن قسم بمئوية كلية ولاية لويزيانا من الفيزياء الحيوية، ويزيانا، لوس انجليس.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 x 20 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430167 | The dishes must be polystyrene |
| 150 x 25 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430599 | The dishes must be polystyrene |
| 150 mm glass Petri dish | Fisher | 3160150BO | |
| 15 ml polystyrene tissue culture plastic tubes | Falcon | 352099 | |
| Methylene chloride | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| silicone rubber sealant | DAP | 7079808641 | |
| ethanol | Decon | 2701 | |
| 3 ml transfer pipette | Becton-Dickinson | 357524 | |
| printer paper | |||
| scissors | |||
| gloves | |||
| rotary tool and set | Dremel | 4000-6/50 | |
| rotary tool cutting head | Dremel | EZ476 | |
| rotary tool drill head | |||
| distilled water | |||
| orbital shaker | VWR | 57018-754 | |
| incubator | |||
| Rat retinal microvascular endothelial cells | Cell Biologics | RA-6065 |
References
- Resnick, N., Gimbrone, M. A. Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression. FASEB J. 9 (10), 874-882 (1995).
- Malek, A. M., Izumo, S. Control of endothelial cell gene expression by flow. J Biomech. 28 (12), 1515-1528 (1995).
- Ando, J., Kamiya, A. Flow-dependent Regulation of Gene Expression in Vascular Endothelial Cells. Jpn Heart J. 37 (1), 19-32 (1996).
- Resnick, N., Yahav, H., et al. Endothelial Gene Regulation by Laminar Shear Stress. Adv Exp Med Biol. 430, 155-164 (1997).
- Gaucher, C., et al. In vitro impact of physiological shear stress on endothelial cells gene expression profile. Clin Hemorheol Mico. 37 (1-2), 99-107 (2007).
- Fisslthaler, B., et al. Identification of a cis -Element Regulating Transcriptional Activity in Response to Fluid Shear Stress in Bovine Aortic Endothelial Cells. Endothelium-J Endoth. 10 (4-5), 267-275 (2003).
- Chen, W., Bacanamwo, M., Harrison, D. G. Activation of p300 Histone Acetyltransferase Activity Is an Early Endothelial Response to Laminar Shear Stress and Is Essential for Stimulation of Endothelial Nitric-oxide Synthase mRNA Transcription. J Biol Chem. 283 (24), 16293-16298 (2008).
- Sumpio, B. E., et al. Regulation of PDGF-B in Endothelial Cells Exposed to Cyclic Strain. Arterioscl Throm Vas. 18 (3), 349-355 (1998).
- Yang, Y., et al. Triplex-forming oligonucleotide inhibits the expression of tissue factor gene in endothelial cells induced by the blood flow shear stress in rats. Acta Pharm Sinic. 41 (9), 808-813 (2006).
- Sumpio, B. E., Chang, R., Xu, W. -J., Wang, X. -J., Du, W. Regulation of tPA in endothelial cells exposed to cyclic strain: role of CRE, AP-2, and SSRE binding sites. Am J Physiol. 273 (5 Pt 1), C1441-C1448 (1997).
- Silberman, M., et al. Shear stress-induced transcriptional regulation via hybrid promoters as a potential tool for promoting angiogenesis. Nato Adv Sci Inst Se. 12 (3), 231-242 (2009).
- Dschietzig, T., et al. Flow-induced pressure differentially regulates endothelin-1, urotensin II, adrenomedullin, and relaxin in pulmonary vascular endothelium. Biochem Biophys Res Commun. 289 (1), 245-251 (2001).
- Nagel, T., Resnick, N., Atkinson, W. J., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Shear stress selectively upregulates intercellular adhesion molecule-1 expression in cultured human vascular endothelial cells. J Clin Invest. 94 (2), 885-891 (1994).
- Bateman, G. A., Levi, C. R., Schofield, P., Wang, Y., Lovett, E. C. The venous manifestations of pulse wave encephalopathy: windkessel dysfunction in normal aging and senile dementia. Neuroradiology. 50 (6), 491-497 (2008).
- Juurlink, B. H. J. Is there a pulse wave encephalopathy component to multiple sclerosis. Curr Neurovasc Res. 12 (2), 199-209 (2015).
- Topper, J. N., Gimbrone, M. A. Jr Blood flow and vascular gene expression: fluid shear stress as a modulator of endothelial phenotype. Mol Med Today. 5 (1), 40-46 (1999).
- Tzima, E., et al. A mechanosensory complex that mediates the endothelial cell response to fluid shear stress. Nature. 437 (7057), 426-431 (2005).
- Li, Y. -S. J., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. J Biomech. 38 (10), 1949-1971 (2005).
- Reinhart-King, C. A., Fujiwara, K., Berk, B. C.
- Frangos, J. A., McIntire, L. V., Eskin, S. G. Shear stress induced stimulation of mammalian cell metabolism. Biotechnol Bioeng. 32 (8), 1053-1060 (1988).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress. J Vis Exp. (59), (2012).
- Reinitz, A., DeStefano, J., Ye, M., Wong, A. D., Searson, P. C. Human brain microvascular endothelial cells resist elongation due to shear stress. Microvasc Res. 99, 8-18 (2015).
- Dewey, C. F., Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A., Davies, P. F. The Dynamic Response of Vascular Endothelial Cells to Fluid Shear Stress. J Biomed Eng. 103 (3), 177 (1981).
- Dardik, A., et al. Differential effects of orbital and laminar shear stress on endothelial cells. J Vasc Surg. 41 (5), 869-880 (2005).
- Honda, S., et al. Ligand-induced adhesion to activated endothelium and to vascular cell adhesion molecule-1 in lymphocytes transfected with the N-formyl peptide receptor. J Immunol. 152 (8), 4026-4035 (1994).
- Watt, S. M., Gschmeissner, S. E., Bates, P. A. PECAM-1: its expression and function as a cell adhesion molecule on hemopoietic and endothelial cells. Leukemia Lymphoma. 17 (3-4), 229-244 (1995).
- Fujiwara, K. Platelet endothelial cell adhesion molecule-1 and mechanotransduction in vascular endothelial cells. J Intern Med. 259 (4), 373-380 (2006).
- Dusserre, N. PECAM-1 Interacts With Nitric Oxide Synthase in Human Endothelial Cells: Implication for Flow-Induced Nitric Oxide Synthase Activation. Arterioscl Throm Vas. 24 (10), 1796-1802 (2004).
- Bagi, Z. PECAM-1 Mediates NO-Dependent Dilation of Arterioles to High Temporal Gradients of Shear Stress. Arterioscl Throm Vas. 25 (8), 1590-1595 (2005).
