Eine effiziente Methode zur Isolierung von Highly Purified RNA aus Samen für die Verwendung in Quantitative Transkriptomanalyse

Zusammenfassung

Wir haben es geschafft, eine Methode zur RNA-Isolierung aus Pflanzensamen zu etablieren, die große Mengen an Ölen, Proteinen und Polyphenolen enthalten, die eine hemmende Wirkung auf die hochreine RNA-Isolierung haben. Unsere Methode eignet sich zur Überwachung der Expression von Genen mit niedrigen Transkripten in Saatgut.

Zusammenfassung

Pflanzensamen sammeln große Mengen an Lagerreserven an, die biologisch abbaubares organisches Material enthalten. Der Mensch ist auf Saatgutvorräte für Nahrungsmittel und als Industriematerial angewiesen. Genexpressionsprofile sind leistungsfähige Werkzeuge, um die Stoffwechselregulation in Pflanzenzellen zu untersuchen. Daher sind für die Pflanzenzüchtung detaillierte, genaue Genexpressionsprofile während der Saatgutentwicklung erforderlich. Die Gewinnung von hochreiner RNA ist für die Erstellung dieser Profile unerlässlich. Um hochreine RNA aus Samen zu isolieren, sind effiziente Methoden erforderlich. Hier beschreiben wir eine Methode zur Isolierung von RNA aus Samen, die große Mengen an Ölen, Proteinen und Polyphenolen enthalten, die eine hemmende Wirkung auf die Isolierung hochreiner RNA haben. Unser Verfahren ermöglicht die Gewinnung von hochreiner RNA aus Samen ohne den Einsatz von Phenol, Chloroform oder zusätzlichen Prozessen zur RNA-Aufreinigung. Diese Methode ist auf Arabidopsis-, Raps- und Sojasaatgut anwendbar. Unsere Methode wird nützlich sein, um die Expressionsmuster von Low-Level-Transkripten in sich entwickelnden und reifen Samen zu überwachen.

Einleitung

Pflanzen produzieren Samen, die Anlass zu der nächsten Generation geben. Samen akkumulieren große Mengen an Speicherreserven, wie Öle, Kohlenhydrate und Proteine, für die post-germinative Wachstum. Die Menschen nutzen Samenspeicherreserven als Quellen für Lebens- und Futtermittel und damit Pflanzensamen sind eine der wichtigsten Lieferanten von essbaren organischen Stoffen weltweit. Samenerträge zu erhöhen, ist eine wichtige Herausforderung in der Pflanzenwissenschaft.

Da Reserven Samenspeicher kommerziell wertvolle Quellen für Lebensmittel und Industriematerialien sind, wurden ^1-6 umfassend untersucht die molekularen Mechanism....

Protokoll

1. Extraktion von Gesamt-RNA aus Pflanzensamen

1. Bereiten Puffersätze, Spin-Säulen, 1,5 und 2,0 ml-Polypropylenröhrchen und Nuklease-freies 1,5 ml Polypropylenröhrchen.
2. 1% (w / v) für die Molekularbiologie Polyvinylpyrrolidon (nachstehend bezeichnet als PVP) Lysepuffer für RNA-Extraktion und kräftig vortexen zu Zelle. Inkubieren für 20 min bei 25 ° C vollständig gelöst. Nach 20 min Inkubation wird durch Drehen des Rohrs den Kopf zu verhindern, die Bildung von Blasen des Puffers vorsichtig mischen. Lagerung bei Raumtemperatur (15-25 ° C) vor dem Gebrauch.
3. Erntefrüchte aus Arabidopsis thaliana - Pflanzen und in 1,5 ml Polypropylen ....

Ergebnisse

Wir untersuchten zunächst die optimale Konzentration von PVP mit Arabidopsis reifen Samen. Gesamt-RNA wurde aus etwa 1000 Samen isoliert gemäß dem Protokoll oben unter Verwendung Zelllysepuffer beschrieben, die 0%, 0,25%, 0,5%, 1,0% bzw. 2,0% PVP. Nach Homogenisierung und Zentrifugation wurde der Überstand gesammelt , während die Ölschicht und Samen Debris (1A) zu vermeiden.

Diskussion

Genexpressionsprofile tragen zum Verständnis der Pflanzenphysiologie; Daher wurden spezifische RNA - Isolierungsverfahren wurden für jede Probe Bedingung ^9-12 entwickelt. Wir untersuchten die Prozesse, die während der RNA-Isolierung aus Samen gehemmt wurden und festgestellt, dass RNA zu Silikamembranen Bindung war stark gehemmt. Große Mengen an Öl, Proteine ​​und Polyphenole hemmen RNA-Isolierung. Wir modifiziert, um die RNA-Extraktionsverfahren dieser Verbindungen mit einer Lyse-Lösung vor dem Prozess der RN.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
RNeasy Plant Mini Kit	QIAGEN	74904
Polyvinylpyrrolidon	Sigma-Aldrich	P5288-100G
HOMOGENISATOR S-303	AS ONE	1-1133-02
NanoDrop Lite	Thermo Scientific	ND-NDL-US-CAN
PrimeScript RT Reagenzkit (Perfect Real Time)	TAKARA	RR037A
KAPA SYBR Schnelles qPCR-Kit	Kapa biosystems	KK4601