Live-Imaging zur Untersuchung Mikrotubuli dynamische Instabilität in Taxan-resistenten Mammakarzinome

Summary

In diesem Artikel berichten wir über ein Protokoll, das eine in vivo-Methode zur Messung der dynamischen Instabilität von Mikrotubuli in Docetaxel-resistenten Brustkrebszellen (MCF-7_TXT) beschreibt. Bei dieser Methode wird ein Dekonvolutionsmikroskopie-Bildgebungssystem verwendet, um die Expression von GFP-Tubulin in Zielzellen nachzuweisen.

Abstract

Taxane wie Docetaxel gehören zu einer Gruppe von Mikrotubuli-Targeting-Wirkstoffen (MTAs), die häufig zur Behandlung von Krebs eingesetzt werden. Die Taxanresistenz in Krebszellen reduziert jedoch die Wirksamkeit der Langzeitanwendung der Medikamente drastisch. Häufende Beweise deuten darauf hin, dass die Mechanismen, die der Taxanresistenz zugrunde liegen, sowohl allgemeine Mechanismen, wie die Entwicklung von Multidrug-Resistenz aufgrund der Überexpression von Wirkstoff-Efflux-Proteinen, als auch Taxan-spezifische Mechanismen, wie z. B. solche, die die Mikrotubuli-Dynamik betreffen, umfassen.

Da Taxane auf Zellmikrotubuli abzielen, ist die Messung der dynamischen Instabilität von Mikrotubuli ein wichtiger Schritt zur Bestimmung der Mechanismen der Taxanresistenz und gibt Aufschluss darüber, wie diese Resistenz überwunden werden kann. Im Experiment wurde eine in vivo-Methode verwendet, um die dynamische Instabilität von Mikrotubuli zu messen. GFP-markiertes α-Tubulin wurde exprimiert und in Mikrotubuli in MCF-7-Zellen eingebaut, was die Aufzeichnung der Mikrotubuli-Dynamik im Zeitraffer mit einer empfindlichen Kamera ermöglichte. Die Ergebnisse zeigten, dass im Gegensatz zu den nicht-resistenten elterlichen MCF-7_CC-Zellen die Mikrotubuli-Dynamik von Docetaxel-resistenten MCF-7_TXT-Zellen unempfindlich gegenüber Docetaxel-Behandlung ist, was die Resistenz gegen Docetaxel-induzierten Mitosestillstand und Apoptose verursacht. In diesem Artikel wird diese in vivo-Methode zur Messung der dynamischen Instabilität von Mikrotubuli vorgestellt.

Introduction

Die Haupttodesursache Brustkrebs ist durch Metastase ^{1, 2.} Taxane wie Docetaxel und Paclitaxel, werden derzeit als First-Line - Therapien bei der Behandlung von metastasierendem Brustkrebs ^{2, 3, 4, 5, 6} verwendet. Sie sind Teil einer Gruppe von Mikrotubuli-Targeting-Mittel (MTAs), die die Dynamik der Mikrotubuli stören. Allerdings ist eine der größten Herausforderungen für die Taxane in kurativen Therapie ist die Entwicklung von Taxan - Resis....

Protocol

1. Vorbereitung der Zellen für Live-Imaging

1. Zellkultur und Seeding
   1. Verwenden MCF-7 Brustkrebszellen , ausgewählt für die Resistenz gegen Docetaxel (MCF-7 _TXT) und deren nicht-resistenten parentalen Zelllinie (MCF-7 _CC). Die detaillierten Auswahlprozess und die Charakterisierung dieser ausgewählten Zelllinien wurden zuvor ²⁴ beschrieben.
   2. Wachsen alle Zellen in 10 cm-Kulturschalen bei 37 ° C in einem Medium, 90% Dulbecco besteht modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) und 10% fötales Rinderserum (FBS) und supplementiert mit nicht-essentiellen Aminosäuren. Pflegen Sie das Medium in ei....

Results

Mit dem Protokoll hier vorgestellten, untersuchten wir die Wirkung von Docetaxel auf die Mikrotubuli - Dynamik der normalen (MCF-7 _CC) und Docetaxel-resistenten (MCF-7 _TXT) Brustkrebszellen. Zwei Sätze von Aufnahmen zeigen die Wirkung von Docetaxel (0,5 uM) auf Mikrotubuli Wachstum und Verkürzung in MCF-7 _CC und MCF-7 - _TXT - Zellen (1A).

Wir auch die Geschwindigkeit.......

Discussion

Es gibt zwei Hauptmethoden Mikrotubuli dynamische Instabilität zu messen: in vitro und in vivo. In dem in vitro - Verfahren wird gereinigtes Tubulin verwendet Mikrotubuli dynamische Instabilität mit Computer-enhanced Zeitrafferdifferentialinterferenzkontrastmikroskopie zu messen. In dem in vivo - Verfahren, mikroinjiziert Fluoreszenz Tubulin oder Tubulin-GFP exprimiert, in Mikrotubuli eingebaut. Die Dynamik (Wachstum und Verkürzung) der Mikrotubuli wird dann durch Zeitraffer unter Ver.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796
Nicht-essentielle Aminosäuren	Life Technologies, Invitrogen	11140-050
FBS	Gibco, Invitrogen	12483
Anti-Anti (100x)	Life Technologies, Invitrogen	15240-062
Docetaxel	Sigma-Aldrich	01885-5mg-F
DMEM phenolrotfrei	Gibco, Invitrogen	21063
CellLight Reagenz *BacMam 2.0* GFP-Tubulin	ThermoFisher Scientific	C10613	Schlüsselreagenz für die Expression von GFP-Tubulin in Zellen
CellLight Reagenz *BacMam 2.0* GFP	ThermoFisher Scientific	B10383	Kontrolle
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma-Aldrich+B9:AA9	472301	zum Auflösen von Decetaxel
22-mm-Glas coveslip	Fisher Scientifics	12-545-101
6-Well-Kulturplatte	Greiner Bio-One International	6-Well-Celi-Kulturplatte
DeltaVision Mikroskopie Bildgebungssysteme	GE Health		Dieses System ist mit einer Wetterstation zur Kontrolle von Temperatur und CO2 ausgestattet. Es ist auch mit Worx Software für die Entfaltungs- und Zeitraffersteuerung ausgestattet.
Trypsin-EDTA (0,25%), Phenolrot	ThermoFisher Scientific	25200056
Bright-Line Hämazytometer-Set, Hausser Scientific	Hausser Scientific, vertrieben von VWR	Lieferanten-Nr.: 1492 VWR Nr.: 15170-172