Die Verwendung von Polydesoxynukleotid-Molekülen (44-mer-Aptamer) zur Erfassung von unchelatierten Gadolinium(III)-Ionen in einer wässrigen Lösung wird beschrieben. Das Vorhandensein des Ions wird über eine Erhöhung der Fluoreszenzemission des Sensors detektiert.
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Methodenartikel
Ein Aptamer-basierten Sensor für unchelatisierte Gadolinium (III)
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Ein Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins von unchelatierten dreiwertigen Gadolinium-Ionen (Gd3+) in wässriger Lösung wird demonstriert. Gd3+ ist häufig in Proben von gadoliniumbasierten Kontrastmitteln als Ergebnis unvollständiger Reaktionen zwischen dem Liganden und dem Ion oder als Dissoziationsprodukt vorhanden. Da das Ion giftig ist, ist sein Nachweis von entscheidender Bedeutung. Darin werden der Aufbau und die Verwendung eines Aptamer-basierten Sensors (Gd-Sensor) für Gd3+ beschrieben. Der Sensor erzeugt eine Fluoreszenzänderung als Reaktion auf steigende Konzentrationen des Ions und hat eine Nachweisgrenze im nanomolaren Bereich (~100 nM mit einem Signal-Rausch-Verhältnis von 3). Der Assay kann in einem wässrigen Puffer bei einem Umgebungs-pH-Wert (~7 - 7,4) in einer 384-Well-Mikroplatte durchgeführt werden. Der Sensor reagiert relativ unempfindlich auf andere physiologisch relevante Metallionen wie Natrium-, Kalium- und Calciumionen, obwohl er nicht spezifisch für Gd3+ gegenüber anderen dreiwertigen Lanthanoiden wie Europium(III) und Terbium(III) ist. Dennoch sind die Lanthanide in Kontrastmitteln oder den biologischen Systemen nicht häufig zu finden, so dass der Sensor zur selektiven Bestimmung von unchelatiertem Gd3+ unter wässrigen Bedingungen verwendet werden kann.
Einleitung
Die zunehmende Bedeutung der Kernspintomographie (MRI) in der klinischen Diagnose, die durch die inhärente Empfindlichkeit der Technik begrenzt ist, hat in dem schnellen Wachstum der Forschung in die Entwicklung von neuartigen Gadolinium-Kontrastmitteln (GBCAs) 1 geführt. GBCAs sind Moleküle , die verabreicht werden , um die Bildqualität zu verbessern, und sie haben typischerweise die chemische Struktur eines dreiwertigen Gadolinium - Ion (Gd 3+) zu einem mehrzähnigen Liganden koordiniert. Diese Komplexbildung ist von entscheidender Bedeutung , da unchelatisierten Gd 3+ ist giftig; es wurde bereits 2 in der Entwicklung von ....
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Protokoll
HINWEIS: die Molekularbiologie Wasser wird in allen Puffer und Lösungs-Präparate eingesetzt. Alle Einweg-Röhrchen (Mikro und PCR) und Pipettenspitzen sind DNase- und RNase-frei. Bitte beachten Sie die Sicherheitsdatenblatt (MSDS) für alle Chemikalien vor der Verwendung. Einsatz einer persönlichen Schutzausrüstung (PSA) wird dringend empfohlen.
1. Herstellung der Stammlösungen Aptamer
- kommerziell Kauf 2 Stränge von Polydesoxynukleotid-. Um beide Stränge mit Reinigung durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC).
Strand 1 (Gd-Aptamer):
5 '- / 56-FAM / AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3'....
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Ergebnisse
Eine typische Fluoreszenzänderung des Gd-Sensorlösung in Gegenwart von unchelatisierten Gd 3+ ist in Abbildung 2 dargestellt. Die Emission kann als die Fluoreszenz - fache Veränderung (2A) oder die rohe Fluoreszenzablesen (2B) in willkürlichen Einheiten aufgetragen werden (AFU). Beide Diagramme ergeben sehr ähnliche Eichkurven mit einem linearen Bereich für die Konzentration von Gd 3+ unter 1 & mgr; M und der Sä.......
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Diskussion
Verwendung der Aptamer-basierten Gd-Sensor, ein Anstieg in der Fluoreszenzemission , die auf die Konzentration des unchelatisierten Gd 3+ proportional ist beobachtet wird . Um die Menge der Probe zu minimieren verwendet wird, kann der Test in einem 384-Well-Mikroplatten mit einer Gesamtprobenvolumen von 45 & mgr; l pro Vertiefung ausgeführt werden. In dieser Konstruktion ist die Wahl von Fluorescein (FAM) und DABCYL (Dab) wurde auf die Kosten der Reagenzien basieren in erster Linie; die Emissionswellenlän.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Wir möchten Dr. Milan N Stojanovic von der Columbia University, New York, NY für wertvollen wissenschaftlichen Input danken. Diese Arbeit wird von der California State University East Bay (CSUEB) und dem CSUEB Faculty Support Grant-Individual Researcher unterstützt. O.E., T.C. und A.L. wurden durch das CSUEB Center for Student Research (CSR) Fellowship unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Gd-Aptamer | IDTDNA | Eingangssequenz und Fluorophormodifikation in der Ordnungsform | Es kann ein Fluorophor mit einer anderen Emissionswellenlänge verwendet werden. Das Aptamer kann auch bei einem anderen Unternehmen bestellt werden. |
| Abschreckstrang | IDTDNA | Inputsequenz und Quenchermodifikation in der Ordnungsform | Es kann ein anderer Quencher für einen optimalen Energietransfer aus dem Fluorophor verwendet werden. Das Aptamer kann auch bei einem anderen Unternehmen bestellt werden. |
| in molekularbiologischer Qualität | Kein bestimmter Hersteller, sowohl DEPC- als auch nicht DEPC-behandelte Produkte funktionieren gleich gut | ||
| Gadolinium(III)-chlorid wasserfreies | Strem | 936416 | |
| Toxisches HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Magnesiumchlorid wasserfrei | MP Biomedicals | 0520984480 - 100 g | |
| Natriumchlorid | Acros Organics | ||
| Kaliumchlorid | Fisher Scientific | P333-500 | |
| Natriumhydroxid, Pellets | Fisher Scientific | BP359 | Korrosive |
| Salzsäure | Fisher Scientific | SA49 | Giftige und korrosive |
| 384-Well-Platten aus schwarzem Polystyrol mit flachem Boden und niedrigem Flansch | Corning | 3575 | Platten, die für Fluoreszenz geeignet sind Lektüre sind erforderlich. |
| Nalgene Rapid-Flow steriler Einweg-Flaschenaufsatzfilter | Thermo Scientific | 5680020 | Der Flaschendeckel ist mit einer 0,2-Mikron-PES-Membran ausgestattet |
| Sterile Einwegflaschen 250 mL | Corning | 430281 | Es kann eine größere oder kleinere Flasche verwendet werden |
| 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen | Kein bestimmter Hersteller, solange es sich um DNAse- und RNAse-freie | ||
| 0,2 mL PCR-Röhrchen | handeltKein bestimmter Hersteller, solange es sich um DNAse und RNAse-freie | ||
| Mikropipetten | Kein bestimmter Hersteller | ||
| Pipettenspitzen (ohne Filter) in entsprechenden Größen | Kein bestimmter Hersteller, solange sie DNAse und RNAse-frei sind | ||
| Equipment | |||
| Plattenleser | Biotek Synergy H1 | Plattenleser anderer Hersteller würden genauso gut funktionieren |
Referenzen
- Shen, C., New, E. J. Promising strategies for Gd-based responsive magnetic resonance imaging contrast agents. Curr. Opin. Chem. Biol. 17 (2), 158-166 (2013).
- Cheong, B. Y. C., Muthupillai, R. Nephrogenic systemic fibrosis: a concise review for car....
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Nachdrucke und Genehmigungen
