Voorwaardelijke herprogrammeren van Pediatric Human slokdarmkanker epitheelcellen voor gebruik in Tissue Engineering and Disease Investigation

Summary

Uitbreiding van menselijke kinderen oesofageale epitheelcellen gebruikmaking voorwaardelijke herprogrammering biedt onderzoekers met een patiënt-specifieke populatie van cellen die kunnen worden gebruikt voor de engineering oesofageale constructen autologe implantatie defecten of letsel behandelen en dienen als een reservoir voor therapeutische screeningstesten.

Abstract

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing various types of stem cells to derive cell types of interest is often costly, time consuming and highly inefficient. Furthermore, undesired cell types must be removed prior to using this cell source, which requires another step in the process. In order to obtain enough esophageal epithelial cells to engineer the lumen of an esophageal construct or to screen therapeutic approaches for treating esophageal disease, native esophageal epithelial cells must be expanded without altering their gene expression or phenotype. Conditional reprogramming of esophageal epithelial tissue offers a promising approach to expanding patient-specific esophageal epithelial cells. Furthermore, these cells do not need to be sorted or purified and will return to a mature epithelial state after removing them from conditional reprogramming culture. This technique has been described in many cancer screening studies and allows for indefinite expansion of these cells over multiple passages. The ability to perform esophageal screening assays would help revolutionize the treatment of pediatric esophageal diseases like eosinophilic esophagitis by identifying the trigger mechanism causing the patient’s symptoms. For those patients who suffer from congenital defect, disease or injury of the esophagus, this cell source could be used as a means to seed a synthetic construct for implantation to repair or replace the affected region.

Introduction

Slokdarmkanker tissue engineering en eosinofiele esophagitis (EoE) hebben de focus van het onderzoek in veel laboratoria de afgelopen tien jaar geweest. Aangeboren afwijkingen, zoals slokdarmatresie worden waargenomen bij ongeveer 1 op 4000 levendgeborenen, waardoor de onvolledige ontwikkeling van de slokdarm leidt tot het onvermogen om te eten ^1. De incidentie en prevalentie van EoE hebben op de stijging sinds de identificatie van de ziekte entiteit 1993. De incidentie van EoE varieerde 0,7-10 / 100.000 per jaar en de prevalentie varieerde 0,2-43 / 100.000 ² geweest. Een aantrekkelijke nieuwe chirurgische benadering van de behandeling lange periode slokdarmatresie bestaat uit het genereren van weefselconstructen voor implantatie gebruikmaking eigen cellen van de patiënt. Deze cellen samen met synthetische steigers zullen autologe construct die geen immunosuppressie vereist genereren. Sommige groepen zijn al begonnen met het ons te onderzoekene van stamcellen-achtige cellen slokdarm weefselmanipulatie ³ en het gebruik van natieve slokdarm epitheelcellen aan het slijmvlies herbevolking ^4-7. Ziekten die in de slokdarm van pediatrische patiënten zijn vaak moeilijk te diagnosticeren of te bestuderen zonder tussenkomst. Bovendien, met behulp van diermodellen of in vitro onsterfelijk gemaakte cellijn modellen voor pediatrische ziekten zoals EoE omvatten niet de exacte pathogenese van de ziekte of de patiënt specifieke ⁸ verschillen. Daarom is de mogelijkheid om ziekteproces een patiënt in vitro bestuderen teneinde specifieke ziekte triggering antigenen te identificeren, evalueren en onderliggende mechanismen te onderzoeken drugbehandelingen nieuw zouden zijn en een clinici informatie die kan helpen bij de behandeling van patiënten.

Er zijn veel autologe of patiënt-specifieke celtypen die voor gebruik in tissu voorgesteld geweeste engineering en de studie van de menselijke ziekte pathogenese. Enkele van deze celtypen zijn beperkt in hun vermogen om voldoende cellen van een specifiek fenotype genereren een grote scaffold zaad of voer high throughput in vitro studies. Het gebruik van pluripotente of multipotente stamcellen is het onderwerp van veel onderzoek gediscussieerd echter beperkingen en tekortkomingen van het gebruik van deze cellen zijn goed beschreven ^9. Het gebruik van menselijke embryonale stamcellen is zeer besproken en presenteert een groot aantal ethische kwesties. Belangrijker, deze cellen vormen teratomas, die vergelijkbaar met een tumor, als ze niet worden onderscheiden van hun pluripotente toestand voor het leveren ze in een levende gastheer ^10. Bovendien zou het gebruik van embryonale stamcellen patiënt-specifiek en zou een allogene reactie en de noodzaak van immuunsuppressie ¹⁰ opwekken. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) zijn pluripotente cellen die kunnenworden afgeleid uit eigen cellen van de patiënt. Somatische cellen, zoals huidcellen, kunnen worden geïnduceerd om een ​​pluripotente toestand met verschillende geïntegreerde als niet-geïntegreerde technieken. Deze cellen dienen dan als een patiënt-specifieke cel bronnen voor tissue engineering of de ziekte van onderzoek. De integratie van ongewenst genetisch materiaal in deze cellen is veel zorg omschreven en zelfs als sequenties volledig verwijderd lijken iPSCs een epigenetische "memory" naar het celtype waaruit ze zijn afgeleid ¹¹ behouden. Deze cellen zullen teratomas vormen in vivo als niet vóór transplantatie ¹¹ gedifferentieerd. Vele differentiatie protocollen zijn onderzocht gericht op epitheliale lijnen ^{12, 13, 14,} echter, is het zeer belangrijk op te merken dat de celtypen verkregen eind differentiatie niet homogeen en only hebben een fractie van het celtype. Dit resulteert in een lage opbrengst en de noodzaak om het gewenste celtype te zuiveren. Hoewel iPSCs zijn een potentiële patiënt-specifieke cel bron, het proces voor het verkrijgen van een celtype van belang zijn voor beide tissue engineering of de ziekte van onderzoek is zeer inefficiënt.

Menselijke epitheelcellen met succes geïsoleerd uit een verscheidenheid aan zowel zieke als niet-zieke weefsels in het menselijk lichaam met inbegrip van: ¹⁵ long-, borst- ^{16, 17} dunne darm, colon ^18, blaas ¹⁹ en de slokdarm ^20. Het is belangrijk op te merken dat de humane primaire cellen een eindig aantal passages waarin het fenotype wordt gehandhaafd ^{21, 22.} Helaas betekent dit dat het aantal cellen nodig zijn voor ziekte onderzoek of zaaien een aangelegde scaffoldvoor implantatie niet wordt verkregen. Daarom zijn nieuwe technieken die nodig zijn om de patiënt cellen uit te breiden, terwijl nog steeds een epitheliale fenotype behoud. Voorwaardelijke herprogrammering van normale en kankercellen epitheelcellen gebruik te maken van feeder-cellen en ROCK-remmer werd in 2012 beschreven door Liu et al. ^{2 3.} Deze techniek werd gebruikt om kankercellen epitheelcellen verkregen uit biopsieën van prostaatkanker en borstkanker gebruikt bestraalde voedingscellen, ROCK inhibitor en voorwaardelijke herprogrammering medium breiden. Het doel was om voldoende cellen voor in vitro assays zoals drugs screenen. Deze techniek kan uitbreiden epitheelcellen onbeperkt door "herprogrammering" deze cellen een stam- of voorouder-achtige toestand, die zeer proliferatieve. Het is aangetoond dat deze cellen niet-tumorigene en hebben het vermogen om teratomas ^{23, 24} vormen bezitten. Bovendien is er geenchromosomale abnormaliteiten of genetische manipulaties waren aanwezig na passage van deze cellen in kweek deze techniek ^{23, 24.} Belangrijker, deze cellen zijn alleen in staat te differentiëren in de natieve celtype plaats. Daarom biedt deze techniek een groot reservoir van patiënt specifieke epitheelcellen voor ziekte onderzoek of weefselmanipulatie zonder de noodzaak voor immortalisatie.

Verkrijgen epitheelweefsel van een specifiek orgaan om ziekteprocessen bestuderen vaak beperkt is en niet altijd mogelijk vanwege het risico patiënt. Voor die patiënten met oesofageale ziekte of gebreken, endoscopische biopsie retrieval is een minimaal invasieve benadering voor het verkrijgen van epitheelweefsel die kunnen worden gedissocieerd en voorwaardelijk geherprogrammeerd onbepaalde celbron die specifiek is voor het slijmvlies van de slokdarm van die patiënt. Dit zorgt dan voor in vitro studiesvan de epitheelcellen ziekteprocessen en onderzoeken op mogelijke therapeutische evalueren. Een ziekteproces die sterk kunnen profiteren van deze aanpak is eosinofiele oesofagitis, die is beschreven als allergische aandoening van de slokdarm ^8. Allergietesten en therapeutische benaderingen kunnen in vitro worden geëvalueerd middels eigen epitheelcellen van de patiënt en deze informatie kan dan binnen de behandelend arts worden doorgegeven geïndividualiseerde behandelingen te ontwikkelen. De techniek van voorwaardelijke herprogrammering in samenhang met het verkrijgen endoscopische biopten van pediatrische patiënten biedt de mogelijkheid om normale slokdarm epitheelcellen onbeperkt uitbreiden van een patiënt. Deze cel bron kan dus samen worden samen met natuurlijke of synthetische steiger aan een patiënt-specifieke chirurgische optie voor gebreken, ziekte of trauma te bieden. Het hebben van een onbepaald aantal cellen zou helpen engineer oesofageale constructies die beschikken over een volledig reseededlumen met oesofageale epitheelcellen om te helpen regenereren van de overblijvende celtypen vergemakkelijken.

Protocol

Slokdarm biopten werden verkregen na geïnformeerde toestemming werd verkregen van de ouders / verzorgers van de pediatrische patiënten en in overeenstemming met de institutionele Review Board (IRB # 13-094). 1. steriliseren van instrumenten en gelatine-oplossing Autoclaaf tang, scheermesjes en scharen voorafgaand aan de behandeling van weefsel om besmetting te voorkomen. Tot 200 ml 0,1% gelatineoplossing te combineren 200 mL gedestilleerd water met 0,2 g gelatine. Autoclaaf en afkoelen voo…

Representative Results

Een overzicht van de belangrijkste stappen bij het isoleren esophageal epitheelcellen van patiënt biopsies wordt samengevat in figuur 1. Kolonies van epitheelcellen wordt gevormd in ongeveer 4-5 dagen en wordt omringd door fibroblast feeder-cellen (Figuur 2A). Aangezien deze kolonies uit te breiden zullen zij fuseren met andere kolonies tot grotere kolonies (figuur 2B) te vormen. Zodra de kweken 70% confluent zijn geworden, moeten ze wo…

Discussion

De belangrijkste stappen om te isoleren en vergroten esophageal epitheelcellen van patiënt biopsies zijn: 1) voldoende dissociëren biopsie weefsel met minimale celdood; 2) zorgen ROCK inhibitor wordt toegevoegd aan het celkweekmedium bij elke mediumverversing; 3) Gebruik niet meer feeder-cellen dan aanbevolen; 4) handhaven van een schone aseptische cultuur; en 5) passage cellen vlak voor het bereiken van samenvloeiing.

Door de patiënt verschillen in biopsie monsters verkregen voor voorwaa…

Materials

Primocin	InVivogen	ant-pm2
Isopentane	Sigma Aldrich	277258-1L
Gelatin From Porcine Skin	Sigma Aldrich	G1890-100G
DMEM	Thermofisher Scientific	11965092
Cryomold	TissueTek	4565
Cryomatrix OCT	Thermofisher Scientific	6769006
15ml Conical Tubes	Denville Scientific	C1017-p
Complete Keratinocyte Serum Free Medium	Thermofisher Scientific	10724011
Penicillin Streptomycin	Thermofisher Scientific	15140122
Glutamax	Thermofisher Scientific	35050061
Insulin Solution	Sigma Aldrich	I9278-5ml
Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Peprotech	AF-100-15
ROCK Inhibitor (Y-27632)	Fisher Scientific	125410
F-12 Medium	Thermofisher Scientific	11765054
Fetal Bovine Serum	Denville Scientific	FB5001
Dispase	Thermofisher Scientific	17105041
0.05% Trypsin-EDTA	Thermofisher Scientific	25300062
0.25% Trypsin-EDTA	Thermofisher Scientific	25200072
100mm Dishes	Denville Scientific	T1110-20
150mm Dishes	Denville Scientific	T1115
50ml Conicals	Denville Scientific	C1062-9
Phosphate Buffered Saline Tablets	Fisher Scientific	BP2944-100
5ml Pipettes	Fisher Scientific	1367811D
10ml Pipettes	Fisher Scientific	1367811E
25ml Pipettes	Fisher Scientific	1367811
9" Pasteur Pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D
NIH 3T3 Cells	ATCC	CRL1658