Dieses Manuskript beschreibt Methoden zur Anwendung der Peptid-Microarray-Technologie auf die Spezifitätsprofilierung von Antikörpern, die Histone und ihre posttranslationalen Modifikationen erkennen.
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Methodenartikel
Analyse der Histon-Antikörper-Spezifität mit Peptid-Microarrays
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Posttranslationale Modifikationen (PTMs) auf Histonproteinen sind weitgehend untersucht für ihre Rollen bei der Regulierung der Chromatinstruktur und der Genexpression. Die Massenproduktion und -verteilung von Antikörpern, die spezifisch für Histon-PTMs sind, hat die Forschung auf diesen Markierungen stark erleichtert. Als Histon-PTM-Antikörper sind Schlüsselreagenzien für viele Chromatin-Biochemie-Anwendungen, eine rigorose Analyse der Antikörperspezifität ist notwendig für eine genaue Dateninterpretation und fortgesetzte Fortschritte auf dem Gebiet. Dieses Protokoll beschreibt eine integrierte Pipeline für die Konstruktion, Herstellung und Verwendung von Peptid-Mikroarrays zur Profilierung der Spezifität von Histon-Antikörpern. Die Design- und Analyseaspekte dieses Verfahrens werden durch ArrayNinja, ein Open-Source- und interaktives Softwarepaket, das wir vor kurzem entwickelt haben, um die Anpassung von Microarray-Druckformaten zu optimieren, erleichtert. Diese Pipeline wurde verwendet, um eine große Anzahl von kommerziell verfügbaren und weit verbreiteten Histon-PTM-Antibiotika zu screenenS und Daten aus diesen Experimenten sind frei verfügbar durch eine Online-und erweiterte Histone Antibody Specificity Database. Jenseits von Histonen kann die hier beschriebene allgemeine Methodik weitgehend auf die Analyse von PTM-spezifischen Antikörpern angewendet werden.
Einleitung
Genomische DNA ist elegant im eukaryotischen Zellkern mit Histonproteinen verpackt, um Chromatin zu bilden. Die sich wiederholende Untereinheit von Chromatin ist das Nukleosom, das aus 147 Basenpaaren von DNA besteht, die um einen oktameren Kern von Histonproteinen - H2A, H2B, H3 und H4 1 gewickelt sind. Chromatin ist weitgehend in lose gepackten Euchromatin und fest verpackten Heterochromatin-Domänen organisiert. Der Grad der Chromatin-Verdichtung regelt das Ausmaß, in dem Protein-Maschineries auf die zugrunde liegende DNA zugreifen können, um fundamentale DNA-templated Prozesse wie Replikation, Transkription und Reparatur durchzuführen.
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Protokoll
1. Installieren und Ausführen von ArrayNinja
- Downloaden und installieren Sie Oracle Virtual Box von www.virtualbox.org.
- Laden und entpacken Sie die ArrayNinja virtuelle Maschine (VM) von http://research.vai.org/Tools/arrayninja.
- Öffnen Sie die virtuelle Box und fügen Sie die ArrayNinja VM hinzu, indem Sie auf "Maschine", "Hinzufügen" klicken und arrayninja.vbox aus dem Ordner auswählen, in dem ArrayNinja VM gespeichert wurde.
- Starten Sie ArrayNinja, indem Sie es in der virtuellen Box auswählen und auf den grünen Pfeil "Start" klicken.
- Virtual Box öffnet ein neues Fenster und zeigt eine Meldung an, auf die die VM zugr....
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Ergebnisse
Dieses Protokoll wurde verwendet, um eine Peptid-Mikroarray-Plattform für die Analyse der Histon-PTM-Antikörperspezifität zu entwerfen und herzustellen. Das Array fragt eine Bibliothek von mehr als 300 einzigartigen Peptidmerkmalen (20 - 40 Reste in der Länge) ab, die viele der bekannten Kombinationen von PTMs darstellen, die auf Kern- und Variantenhistonproteinen gefunden wurden 38 . Diese Pipeline war ein Arbeitspferd für das Screening von vielen weit verbreitet.......
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Diskussion
Die Zuverlässigkeit der Antikörper in biomedizinischen Forschungsanwendungen liegt im Mittelpunkt 46 , 47 . Dies trifft besonders für die Chromatin-Biochemie zu, da die Position von Antikörpern als Schlüsselinstrumente für die Mehrheit der Techniken zur Charakterisierung der Häufigkeit und Verteilung von Histon-PTMs entwickelt wurde. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt eine optimierte Pipeline für die Konstruktion, Herstellung und Verwendung von Peptid-Mi.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde zum Teil vom Van Andel Research Institute und einem Forschungsstipendium der National Institutes of Health (CA181343) an SBR unterstützt
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Druckpuffer | ArrayIt | PPB | |
| BSA | Omnipure | 2390 | |
| Streptavidin-beschichtete Glasobjektträger | Greiner Bio-one | 439003-25 | |
| Polypropylen 384 Well-Platte | Greiner Bio-one | 784201 | |
| Biotin-fluorescein | Sigma | 53608 | |
| Kontakt Microarray Drucker | Aushon | 2470 | Aushon 2470 Microarray-Drucker |
| Kontakt-Microarray-Drucker | Genmaschinen | OmniGrid 100 | OmniGrid Microarray-Drucker |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Blocking Buffer | ArrayIt | SBB | |
| Hydrophober Wachsstift | Vector Labs | H-4000 | ImmEdge Hydrophober Barriere-PAP-Stift |
| Silikon Dichtung | Grace Bio-labs | 622511 | |
| Hybridisierungsgefäß | Thermo Scientific | 267061 | oder ähnliches Gefäß |
| Fluoreszenzfarbstoff-konjugierter Sekundärantikörper | Life Technologies | A-21244 | Alexa Fluor 647 (Anti-Kaninchen) |
| Fluoreszenzfarbstoff-konjugierter Sekundärantikörper | Life Technologies | A-21235 | Alexa Fluor 647 (Anti-Maus) |
| Wachs Imprinter | ArrayIt | MSI48 | |
| Tween-20 | Omnipure | 9490 | |
| Microarray Scanner | Innopsys | InnoScan 1100AL | oder gleichwertiger Microarray Scanner |
| EipTitan Histon Peptid Microarray | Epicypher | 112001 | |
| AbSurance Pro Histon Peptid Microarray | Millipore | 16668 | |
| MODified Histone Peptide Array | Active Motif | 13001 | |
| Histon-Code-Peptid-Microarrays | JPT | His_MA_01 | |
| Wax | Royal Oak | GulfWax | für Wachsimprinter |
| Befeuchtete Microarray-Objektträger-Hybridisierungskammer | VWR | 97000-284 | |
| Hochdurchsatz-Mikroskop für Objektträgerwaschkammer | ArrayIt | HTW | |
| Mikroskop Objektträgerzentrifuge | VWR | 93000-204 | |
| Antikörper 1 | Abcam | 8898 | |
| Antikörper 2 | Millipore | 07-473 | |
| Biotinyliertes Histonpeptid | EpiCypher | 12-0001 | Beispielpeptid. Ähnliche Peptide mit verschiedenen Modifikationen sind aus verschiedenen kommerziellen Quellen erhältlich. |
| ImageMagick | https://www.imagemagick.org/script/index.php | ||
| ArrayNinja | https://rothbartlab.vai.org/tools/ |
Referenzen
- van Steensel, B. Chromatin: constructing the big picture. EMBO J. 30 (10), 1885-1895 (2011).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
- Rothbart, S. B., Strahl, B. D.
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Nachdrucke und Genehmigungen
