Immunohistochemia Quantitativa del Microambiente Cellulare in Riapplicazioni del Glioblastoma Paziente
Summary
Questo protocollo è stato sviluppato per identificare quantitativamente i componenti del microambiente del tumore nelle resezioni dei pazienti con glioblastoma utilizzando immunohistochemistry cromogene e ImageJ.
Abstract
Con il crescente interesse per il microambiente del tumore, abbiamo deciso di sviluppare un metodo per determinare in modo specifico i componenti del microambiente nei campioni dei pazienti di glioblastoma, il cancro al cervello più letale e più invasivo. Non solo metodi quantitativi utili per descrivere in modo preciso i tessuti malati, possono anche contribuire alla prognosi, alla diagnosi e allo sviluppo di sistemi e sostituzioni sintetici. Nel glioblastoma, le cellule gliali, come microglia e astrociti, sono state correlate indipendentemente con una prognosi scadente basata sulla classificazione patologica. Tuttavia, lo stato di queste cellule e di altri componenti di cellule gliali non è stato ben descritto in modo quantitativo. Ciò può essere difficile a causa dei grandi processi che segnano queste cellule gliali. Inoltre, la maggior parte delle analisi istologiche si concentrano sul campione globale del tessuto o solo all'interno della maggior parte del tumore, al contrario di delineare quantificazioni basate sulle regioniIl tessuto molto eterogeneo. Qui descriviamo un metodo per identificare e analizzare quantitativamente le popolazioni delle cellule gliali all'interno della massa tumorale e delle regioni adiacenti di resezione tumorale da pazienti con glioblastoma. Abbiamo utilizzato immunohistochemistry cromogeno per identificare le popolazioni di cellule gliali nelle resections del tumore del paziente e ImageJ per analizzare la copertura percentuale di colorazione per ogni popolazione gliale. Con queste tecniche possiamo descrivere meglio le cellule gliali in tutte le regioni del microambiente tumorale degli amiomi.
Introduction
Il glioblastoma (GBM), il cancro al cervello più comune e maligno, è caratterizzato da un'invasione altamente diffusa dalla massa tumorale primaria nel cervello sano, parenchima 1 , 2 . Questa invasione diffusa rende particolarmente difficile il respiro del tumore, e le cellule tumorali invasive che rimangono post-terapia sono il motivo più comune per la ricorrenza inevitabile 2 , 3 , 4 . In precedenza, abbiamo trovato inibendo l'invasione di cellule diffuse degli gliomi per essere terapeuticamente vantaggiosa 5 , tuttavia poco si sa circa i complessi meccanismi che contribuiscono all'invasione GBM. Il microambiente del tumore, o il tessuto che circonda il cancro, è stato implicato nella progressione dei tumori nei tumori multipli 6 , 7 . Il microambiente del tumore di glioblastoma, in pArticolare, è relativamente poco caratterizzato ed è univoco complesso, composto da cellule gliali multipli, come astrociti, microglia e oligodendrociti, così come matrice extracellulare, fattori solubili e fattori biofisici. Sperimentalmente, gli astrociti e la microglia sono stati dimostrati per aumentare la progressione dell'loma e l'invasione 8 , 9 , 10 , ma la composizione di tutte le cellule gliali nel cervello umano nativo microambiente è sconosciuta.
Abbiamo precedentemente mostrato che i componenti microambientali possono prevedere la sopravvivenza del paziente analizzando quantitativamente i componenti cellulari del microambiente glioblastoma e incorporando le nostre analisi in un modello di rischio proporzionale 11 . Qui descriviamo il metodo di analisi quantitativa per identificare le popolazioni delle cellule gliali all'interno della massa tumorale e delle regioni adiacenti di resezione tumorale del paziente glioblastomaS. Abbiamo utilizzato immunohistochemistry cromogeno per identificare le popolazioni di cellule gliali e ImageJ per analizzare la copertura percentuale di colorazione per ogni popolazione gliale. La valutazione della percentuale di copertura crea una misurazione semplice per determinare le differenze morfologiche delle cellule, in particolare quelle colpite dalle interazioni con le cellule tumorali. Precedenti studi per la quantificazione della colorazione istopatologica usano la colorazione standard come l'ematoxilina e l'eosin 12 o il tricromo 13 di Masson, che non approfittano della specificità della colorazione immunohistochemica a base di anticorpi. Il nostro metodo è stato sviluppato per quantificare direttamente le popolazioni gliali nelle resezioni tumorali del paziente glioblastoma, che intendiamo utilizzare per chiarire il microambiente complesso di glioblastoma.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il nostro metodo proposto qui è un approccio quantitativo per l'analisi dei campioni istologici macchiati usando l'immunohistochemistry tradizionale cromogeno. La metodologia attuale per questo tipo di analisi comprende protocolli di colorazione similari seguiti da classificazione da patologi indipendenti. Questo metodo è stato affidabile, tuttavia per una serie di applicazioni è necessaria una comprensione più precisa del trucco cellulare, come una migliore comprensione dell'eterogeneità associata ai t…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano i dottori. Fahad Bafakih e Jim Mandell per l'acquisizione e l'identificazione di campioni di pazienti, Garrett F. Beeghly per l'assistenza con immunohistochemistry e il Biorepository and Tissue Research Facility, il Centro di Histologia del Centro Cardiovascolare e l'Analisi Biomolecolare presso l'Università di Virginia per assistenza L'acquisizione di campioni, l'immunohistochemistry e l'imaging.
Materials
| Xylene | Fisher Chemical | X3P | |
| Ethanol | |||
| High pH antigen unmasking solution | Vector Labs | H-3301 | |
| TBS | |||
| Triton-X | Amresco | 9002-93-1 | |
| Horse serum | |||
| Anti-ALDH1L1 | abcam | ab56777 | |
| Anti-Iba1 | abcam | ab5076 | |
| Anti-Oligodendrocyte Specific Protein1 | abcam | ab53041 | |
| ImmPRESS anti-goat | Vector Labs | MP-7405 | |
| ImmPRESS Universal (anti-mouse/rabbit) | Vector Labs | MP-7500 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | 216763 | |
| ImmPACT DAB substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| Hematoxylin counterstain | ThermoScientific | 72404 | |
| Histochoice Mounting Media | Amresco | H157-475 | |
| Aperio Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Image Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Super HT PAP Pen | Research Products International | 195506 |
Referenzen
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