Am häufigsten Darm Inhaltsanalysen der Makroinvertebraten sind visuell. Intensive Kenntnisse über morphologische Vielfalt der Beute Organismen erfordern, sie vermissen weichen vollmundigen Beute und durch starke Zerkleinerung von Beute, sind fast unmöglich für einige Organismen, einschließlich Amphipoden. Wir bieten detaillierte, neuartigen gentechnische Ansätze für Soisgrabenbaches Identifikation in der Ernährung der Amphipoden Beute.
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Methodenartikel
Laborprotokoll für genetische Darm Inhaltsanalysen der aquatischen Makroinvertebraten Using gruppenspezifische rDNA Primer
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Analyse von Nahrungsketten ist essentiell für ein besseres Verständnis von Ökosystemen. Nahrungsnetz-Interaktionen können zum Beispiel schwere Veränderungen verursacht durch die Invasion der nicht heimischer Arten unterziehen. Eine genaue Identifizierung der Feld-Räuber-Beute-Interaktionen ist jedoch in vielen Fällen schwierig. Diese Analysen basieren häufig auf eine visuelle Beurteilung der Darm Inhalt oder die Analyse der stabile Isotopenverhältnisse (δ15N und δ-13C). Solche Methoden erfordern umfassende Kenntnisse über, bzw. morphologische Vielfalt oder isotopische Unterzeichnung von einzelnen Beute Organismen, zu Hindernissen bei der genauen Identifizierung von Beute Organismen. Visuelle Darm Inhaltsanalysen unterschätzen besonders weichen vollmundigen Beute Organismen, weil Mazeration, Nahrungsaufnahme und Verdauung der Beute Organismen Identifizierung von spezifischen Arten erschweren. Daher Polymerase-Kettenreaktion (PCR) basierte Strategien, zum Beispiel die Verwendung von gruppenspezifischen Primer setzt, bieten ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung von Nahrungsnetz-Interaktionen. Hier beschreiben wir ausführliche Protokolle zur Untersuchung der Darminhalt der Verbraucher denkt vom Feld mit gruppenspezifischen Primer-Sets für nukleare ribosomale Desoxyribonukleinsäure (rDNA). DNA kann entweder vom ganzen Exemplare (bei kleinen Taxa) extrahiert oder aus Darminhalt im Feld gesammelten Exemplare. Präsenz und Funktionstüchtigkeit der DNA Vorlagen direkt von der getesteten Person bestätigt werden müssen mit universal Primer setzt gezielt die jeweiligen Untereinheit der DNA. Wir zeigen auch, dass verbrauchte Beute bestimmt werden kann, weiter bis auf Artniveau über PCR mit unveränderten gruppenspezifischen Primer, verbunden mit nachfolgenden Einzelstrang Konformation Polymorphismus (SSCP) Analysen mittels Polyacrylamid-Gele. Darüber hinaus zeigen wir, dass die Verwendung von unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen als Etiketten parallel Screening für DNA-Fragmente unterschiedlicher Beute Gruppen aus mehreren Darm Inhalt Proben über automatisierte Fragment Analyse ermöglicht.
Einleitung
Räuber-Beute-Interaktionen, die die Mehrheit der trophischen Interaktionen und Nahrungsnetz Dynamik darstellen, sind wichtige Aspekte charakterisieren die Fluten von Materie und Energie im gesamten Nahrungsnetze innerhalb und zwischen den Ökosystemen, die eines der wichtigsten Ziele der Ökologie ist 1. die Bestimmung der Quelle und Fluss von Kohlenstoff und Nährstoffen fördert das Verständnis der ökologischen Vernetzung zwischen Ökosystemen2. Ökosysteme, wie Flüsse und ihre Einzugsgebiete werden jedoch nicht nur durch Fluten von organischen Stoffen und Nährstoffen, sondern auch durch die Bewegungen der Organismen
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Protokoll
1. Makroinvertebraten aus dem Feld zu sammeln und bereiten die Proben für genetische Darm Inhaltsanalysen.
- Sammeln Makroinvertebraten an jedem Standort sortieren Individuen Verbraucher Art von Interesse in einzelne Rohre und direkt Einfrieren in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis, Darm-Clearance und Abbau der DNA zu verhindern.
Hinweis: Vermeiden Sie Proben in Alkohol, zu speichern, weil einige Makroinvertebraten Erbrechen tendenziell vor der Alkohol tötet. - Verwenden Sie nur den Magen-Darmtrakt von mittelgroßen und großen (ca. > 3 mm) denkt Arten für genetische Darm Inhaltsanalysen, sodass die verbleibenden Angelegenheit der P....
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Ergebnisse
Wir haben erfolgreich in diesem Protokoll für Diät-Analysen im Rahmen verschiedener Studien beschriebenen Schritte. In diesem Abschnitt zeigen wir Beispiele beschreiben die Anwendbarkeit der einzelnen Abschnitte des Protokolls.
Als Beispiel um die Wirksamkeit von gruppenspezifischen Primer-Sets von der Autoren-28 und das Potenzial der nachgeschalteten Analysen der PCR-Produkte von SSCP Analysen, gegründet.......
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Diskussion
Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache und kostengünstige Methode für PCR-basierte Bestimmung der Räuber-Beute-Interaktionen von Feldproben über gruppenspezifischen Primer für rDNA Regionen, die mit anderen nicht-molekulare Analysen der gleichen Proben kombiniert werden können. Allerdings gibt es einige wichtige Schritte im Rahmen des Protokolls. Erstens ist es wichtig, versichert die Spezifität der Primer verwendet. Zweitens ist es wichtig zur Vermeidung von Verschmutzung und Verlust der Darm Inhalt Material bei der .......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Wir danken Silke Classen vom Forschungsinstitut für Ökosystem Analyse und Bewertung (Gaiac), RWTH Aachen für ihre Hilfe bei der Schaffung der in diesem Protokoll verwendeten gruppenspezifischen Primer-Sets. Wir danken auch Peter Martin und Laura Schynawa von der Universität Kiel für die Zusammenarbeit in der Wasser-Milben-Experimente. Wir danken auch der technische Laboranten zur Aufbewahrung Labor reibungslos läuft und das Register der Unternehmen und Katalognummern vorbereiten. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, Projekt GE 2219/3-1) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| flüssiger Stickstoff | Beliebig | NA | Für den Transport von Feldproben von Makroinvertebraten ins Labor. |
| 1,5 ml Reaktionsgefäße - Safelock | Any | NA | Für die Entnahme von Verbraucherproben im Feld und die anschließende Konservierung in flüssigem Stickstoff müssen Reaktionsröhrchen nicht unbedingt PCR-sauber sein. Um ein Explodieren der Röhrchen zu vermeiden, sollte der Deckel der Röhrchen mit einer Nadel durchstochen werden. |
| Stereomikroskop | Beliebig | NA | Stellen Sie sicher, dass die Vergrößerung geeignet ist, um den Magen-Darm-Trakt der Größe des interessierenden Verbrauchers vorzubereiten. |
| Petrischalen | Beliebig | NA | Zum Sezieren des Magen-Darm-Trakts von Verbraucherproben unter dem Stereomikroskop. |
| Edelstahl-Foceps: Dumont Pinzette Nr. 7 | Bioform | B40d | Diese gebogene Pinzette aus Edelstahl kann manchmal sehr leicht sein, um die Probe zwischen dem gebogenen Teil zu halten, ohne den Magen-Darm-Trakt zu durchstechen. |
| Edelstahl-Foceps: Dumont Pinzette Electronic Nr. 5 | Bioform | B40b | Diese feine Edelstahl-Pinzette eignet sich hervorragend für die Aufbereitung des Magen-Darm-Trakts von Verbraucherproben. |
| DNA-ExitusPlus | AppliChem | A7409,1000RF | Dekontaminationslösung zur Entfernung von DNA- und RNA-Kontaminationen |
| fusselfreies Papiertuch | Jede | NA | |
| Laborwaage | Jede | NA | Die Genauigkeit muss mindestens 0,01 g betragen. |
| Mikroliter-Pipetten (0,5-10/10-100/50-200/100-1000 μ L) | Alle | NA | |
| Safe-Lock Röhrchen 2,0 ml | VWR | 211-2165 | Es ist entscheidend, dass diese Röhrchen frei von DNA, DNase, RNase und PCR-Inhibitoren sind (PCR clean)! |
| Safe-Lock Röhrchen 1,5 ml | VWR | 211-2164 | Es ist entscheidend, dass diese Röhrchen frei von DNA, DNase, RNase und PCR-Inhibitoren sind (PCR clean)! |
| Natriumchlorid ≥ 99,5%, p.a., ACS, ISO | Carlroth | 3957.3 | Für Salzextraktionspuffer (SEB) und 5M NaCl-Lösung, die für die Extraktion von DNA benötigt wird. |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethan Tris | carlroth | 4855.2 | Für Salzextraktionspuffer (SEB) und FSME-Puffer |
| Mikroliterpipetten (0,5-10/10-100/50-200/100-1000 μ L) | carlroth | 8043.1 | Für Salzextraktionspuffer (SEB) und FSME-Puffer |
| Borsäure ≥ 99,8 %, p.a., ACS, ISO | Carlroth | 6943.2 | Für TBE-Puffer. Nicht erforderlich, wenn kommerziell verfügbarer FSME-Puffer bezogen wird. |
| Natriumdodecylsulfat (SDS) | carlroth | 4360.1 | Zur Extraktion von DNA, |
| Proteinase K, Lyophil. | Carlroth | 7528.1 | Arbeitslösung mit einem Inhalt von 10 mg/ml herstellen. |
| TissueLyser II | Quiagen | 85300 | Kugelmühle zur Homogenisierung der Proben. |
| Edelstahlperlen, 5 mm | Quiagen | 69989 | Zum Homogenisieren von Proben. |
| Heizung Thermoshaker | Jeder | NA | |
| Vortex-Mischer | Jeder | NA | |
| Kühlzentrifuge: himac CT 15 RE | Hitachi | NA | Kühlzentrifuge für die Zentrifugation während der Extraktion von DNA (Protokoll 1). |
| Isopropanol | Carlroth | 6752,5 | |
| Ethanol 99,8 %, p.a. | Jedes | ||
| Wasser Molekularbiologisches Wasser (ddH2O) | AppliChem | A7398,1000 | nukleasefreies (stromsterilisiertes und DEPC-behandeltes) Wasser, das zur Resuspension von DNA verwendet wird, und wann immer im Manuskript auf ddH2O Bezug genommen |
| wird Unmodifizierte Olegonukleotide | Eurofins MWG Operon | NA | Primer unmarkiert |
| Modifizierte Olegonukleotide | Metabion International AG | NA | Primer gelabelt |
| peqGOLD Taq all inclusive | VWR Peqlab | 01-1000 | Taq all inclusive für PCR-Reaktionsgemische (Reaktionspuffer Y und S, dNTPs und MgCl2) |
| Primus 96 advanced gradient thermocycler oder peqStar96x Universal Gradient | Peqlab | NA | Die Primer-Sets wurden ursprünglich auf einem Primus 96 Advanced Gradient Thermocycler erstellt. Da dieser Cycler schon recht alt war, haben wir dann mit dem peqSta96x (der auch das ältere Modell simulieren konnte) überprüft, ob unsere Primer-Sets unter den gleichen Bedingungen effizient und spezifisch sind. Tests haben jedoch gezeigt, dass unsere Primer gut funktionieren und immer noch spezifisch sind (vgl. Koester et al. 2013), ohne die Simulation der alten Maschine zu verwenden. |
| Standard 96-Well-PCR-Platten | VWR Peqlab | 732-2879 | Wird für PCR-Reaktionen verwendet. |
| Low Profile Tube Stripes 0,15 ml mit Flat Cap Stripes | VWR Peqlab | 732-3223 | Cap Stripes zum Verschließen der PCR-Platten. |
| Agarose | Peqlab | 35-1020 | Wird für die Gelelektrophorese verwendet. |
| Mikrowelle | Beliebig | NA | |
| Konuskolben | Beliebig | NA | |
| Messzylinder | Beliebig | NA | |
| Horizontale Elektrophoreseeinheit und entsprechende Kämme mit Zähnen | Beliebig | NA | Für die Agarose-Gelelektrophorese. |
| Elektrophorese-Netzteil PS3002 | Life Technologies | NA | |
| Ethidiumbromidlösung 1 % | Carlroth | 2218.1 | Wird zur Herstellung eines Färbebades für Agarosegele verwendet. |
| Formamid | Carlroth | 6749.1 | Wird für den Denaturierungspuffer für SSCP-Analysen benötigt. |
| Bromphenolblau | AppliChem | A3640.0010 | Wird für den Ladefarbstoff für die Agarose-Gelelektrophorese benötigt. |
| Saccharose | Carlroth | 4621.1 | Wird für den Ladefarbstoff für die Agarose-Gelelektrophorese benötigt. |
| 100 bp-DNA-Leiter verlängertes | Carlroth | T835.1 | Als Größenstandard für die Agarose-Gelelektrophorese. |
| UV-Dokumentationssystem | Beliebig | NA | Zur Visualisierung von Gelelektrophorese-Ergebnissen. |
| Rotiphorese NF-Acrylamid/Bis-Lösung 40 % (29:1) | Carlroth | A121.1 | Zur Herstellung von Polyacrylamid-Gelen. |
| Ammoniumperoxydissulfat | Carlroth | 9592.2 | Zur Herstellung von Polyacrylamid-Gelen. |
| Foldback-Clips (32 mm) | Beliebig | NA | Für die Herstellung von Polyacrylamid-Gelen. |
| quadratische Kunststoffdose (21 x 6,5 x 5 cm) | Alle | NA | Zur Herstellung von Polyacrylamid-Gelen. |
| Tetramethylethylendiamin (TEMED) | carlroth | 23.67.1 | Zur Herstellung von Polyacrylamid-Gelen. |
| Becher | Any | NA | |
| RC 10 Digitaler Kühler | VWR | 462-0138 | Für SSCP-Analysen mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese. |
| Vertikale Elektrophoreseeinheit P10DS (OWL Separation Systems) | VWR | 700-2361 | Für SSCP-Analysen mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese. |
| Gekerbte Glasplatte | VWR | 730-0261 | Für SSCP-Analysen mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese. |
| Blinde Glasplatte | VWR | 730-0260 | Für SSCP-Analysen mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese. |
| Spacer | VWR | 730-0262 | Für SSCP-Analysen mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese. |
| Kamm mit 25 Zähnen | VWR | 730-0294 | Für SSCP-Analysen mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese. |
| Rüttelplattform | Beliebig | NA | Zum ständigen Schütteln des Färbebades. |
| GelStar Nukleinsäure-Fleck (Lonza Rockland, Inc.) | Biozym | 850535 (50535) | Zum Färben von Polyacrylamid-Gelen. |
| GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp | AB Sciex | 608098 | Für automatisierte Fragmentanalysen. Größenstandard für Charge B. |
| GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp | AB Sciex | 608095 | Für automatisierte Fragmentanalysen. Größenstandard für Charge A. |
| Sample Loading Solution (SLS) | AB Sciex | 608082 | Für automatisierte Fragmentanalysen. |
| Sequenzierungsplatte - 96 Well Polypropylen-PCR-Mikroplatte | Costar | 6551 | Für automatisierte Fragmentanalysen. |
| Plattenzentrifuge, PerfectSpin P | VWR Peqlab | NA | Mini-Plattenzentrifuge zum Schleudern von PCR-Produkten. |
| Pufferplatte - 96 Well EIA/RIA Durchsichtiges Polystyrol mit flachem Boden, unbehandelte Mikroplatte | Corning | 9017 | Für automatisierte Fragmentanalysen. |
| GenomeLab Trennpuffer | AB Sciex | 608012 | Für automatisierte Fragmentanalysen. |
| Trenngel - LPAI | AB Sciex | 608010 | Für automatisierte Fragmentanalysen. |
| Sequenzer - CEQ8000 genetisches Analysesystem | Beckman Coulter | NA | Für automatisierte Fragmentanalysen. |
| GeneMarker V1.95 | Softgenetics | NA | Zur Analyse der Ergebnisse automatisierter Fragmentanalysen. |
Referenzen
- Carreon-Martinez, L., Heath, D. D. Revolution in food web analysis and trophic ecology: diet analysis by DNA and stable isotope analysis. Mol Ecol. 9 (1), 25-27 (2010).
- Hardy, C. M., Krull, E. S., Hartley, D. M., Oliver, R. L.
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Nachdrucke und Genehmigungen
