Cirugía piezoeléctrica ha conducido a mejoras en cirugía maxilofacial y dental humana. Hemos desarrollado un protocolo para optimizar la cirugía piezoeléctrica para cirugía craneal ventana en ratones.
Microscopía multifotón ha sido ampliamente adaptado para la proyección de imagen las neuronas en vivo. Proyección de imagen repetida requiere la implantación de una ventana craneal o adelgazamiento repetidas del cráneo. Ventana craneal cirugía generalmente se realiza con un taladro de alta velocidad, y muchos investigadores encuentran difícil para evitar que el taladro los delicados dura y los vasos sanguíneos. Amplia formación y la práctica es necesario quitar el hueso sin daño al tejido subyacente y así ventana craneal cirugía puede ser difícil, consume tiempo y producir daño tisular. Cirugía piezoeléctrica, que se utiliza extensivamente para la cirugía maxilofacial y dental, utiliza vibraciones ultrasónicas para eliminar el hueso sin dañar los tejidos blandos. Hemos desarrollado un método de aplicar cirugía piezoeléctrica para mejorar la cirugía craneal ventana en ratones en preparación para la proyección de imagen multifotón. Comparaciones dentro de nuestro laboratorio de encuentran que el método requiere menos tiempo de cirugía y tiene una menor tasa promedio de complicaciones debido a hemorragia dural que la cirugía de ventana craneal con un taladro.
Cirugía de ventana craneal para preparar roedores multifotón imágenes en vivo se ha convertido en una técnica importante en Neurociencia. La remoción o adelgazamiento del hueso es necesario preparar el ratón para la proyección de imagen óptica con un microscopio multifotón. Esta cirugía se realiza por quitar completamente una zona del hueso para exponer la dura subyacente1, o por el adelgazamiento de una región del hueso sin el retiro completo de la dura2. El enfoque fino del cráneo puede producir menos inflamación y la activación de la microglia3 pero ofrece una menor profundidad de la proyección de imagen, un tamaño más pequeño de la ventana imagen (200 μm) y un período de tiempo limitado durante el cual la ventana puede ser reflejada debido a la regeneración de hueso2 . La adición de una ventana de cristal pulido y reforzado (puertos) puede aumentar el tamaño de imagen y el período de proyección de imagen pero es difícil de realizar4.
Ambas cirugías actuales utilizan un taladro de alta velocidad a fina o quitar el hueso del cráneo. La técnica cráneo fina también utiliza un bisturí después el taladro a la más delgada del hueso2. La técnica de los puertos requiere el paso adicional de alta velocidad de pulido con arena4. En una alta velocidad rotatoria del taladro, una turbina de aire o motor eléctrico hace que la broca al girar a alta velocidad. Como taladros rotativos sección de hueso y tejidos blandos, existe el riesgo de dañar la duramadre y subyacentes de los vasos sanguíneos. El éxito de la cirugía depende de la habilidad del cirujano. Además de estas ventanas con métodos quirúrgicos mecánicos, un método químico de ópticamente claro el cráneo con diferentes soluciones ha sido desarrollado5,6. Sin embargo, puesto que la cirugía piezoeléctrica es un método mecánico de la cirugía, aquí nuestras comparaciones se limitará a otros métodos mecánicos.
Piezoeléctrico de Aparatos quirúrgicos utilizan vibraciones ultrasónicas para romper hueso mineralizado sin dañar los tejidos blandos subyacentes y así ofrecen una aproximación para lograr rápidamente una gran área de hueso. En una pieza de mano quirúrgica piezoeléctrico, la turbina se sustituye por una pila de discos de cerámica y cuando se aplica corriente, los discos vibran a frecuencias ultrasónicas. Las vibraciones se transmiten a través de la pieza de mano para diamante recubiertos consejos para cortar el hueso sin dañar los tejidos blandos, una ventaja sobre taladros rotatorios que no discriminan entre tipos de tejidos. Cirugía piezoeléctrica fue desarrollada originalmente para su uso en humanos por Tomaso Vercellotti y ha conducido a mejoras en dental y cráneo-maxilofacial cirugía7,8,9,10,11 .
Cirugía piezoeléctrica se ha utilizado para crear una osteotomía en ratas Wistar y fue encontrada por la proyección de imagen de resonancia magnética (MRI) y la histología para producir significativamente menos daño que un taladro dental tradicional12. Los autores concluyeron que la cirugía piezoeléctrica fue segura para quitar el hueso cerca tejido cerebral suave. Ratones, sin embargo, tienen una dura más delgado que se daña más fácilmente, y ese estudio no preparar windows para la proyección de imagen óptica crónica. La proyección de imagen crónica requiere que no estén dañados los vasos sanguíneos y que no forman coágulos de sangre debajo de la ventana. Daño a la duramadre conduce a la inflamación que causa la ventana para la nube, y activa la microglia y la proliferación de astrocytes reactivos. Aquí hemos optimizado la cirugía piezoeléctrica para ratones crear delgada cráneo y hueso completo windows craneal extracción conveniente para la proyección de imagen de crónica. Comparamos esta técnica quirúrgica de cirugías de ventana craneal con un taladro de alta velocidad.
La cirugía puede modificarse cambiando la punta quirúrgica. Hay muchos diversos tamaños de punta que se puede aplicar a la pieza de mano. Cambiar el tamaño o la forma de la punta se traducirá en diferentes grandes ventanas. Además de la punta de 4 mm, también intentó una punta de 3 mm y encontró también funcionó bien. Incluso con riego de hielo frío ACSF, no fuimos capaces de obtener buenos resultados con consejos que eran demasiado estrechas (aproximadamente 0,25 mm) debido a las vibraciones concentradas causando demasiado calor y quema el hueso que lleva al daño a la duramadre subyacente. No hemos intentado la multitud de otros consejos que están disponibles, y esperamos que otros laboratorios puedan encontrar nuevas aplicaciones para estos consejos diferentes. Mientras que la cirugía es relativamente sencilla, encontramos que hay varios pasos que pueden requerir la solución de problemas. La primera es que la punta vibrante produce mucha turbulencia en la ACSF, que produce dificultad en determinar la profundidad del hueso durante el paso de la cirugía de reducción del hueso y disminuye la visibilidad. Recomendamos que si es muy difícil ver lo delgado el hueso es, tomar un descanso para secar el cráneo y la ventana aplicando un hisopo de algodón estéril en la parte del hueso. No aplique el aplicador de algodón directamente a la ventana, ya que la superficie rugosa es perjudicial para el hueso fino. Después de comprobar la profundidad, aplicar ACSF y continuar con la cirugía. También se encontró que si existe daño a la duramadre, es generalmente debido al cirujano poner demasiada presión en la punta. Sosteniendo la pieza de mano más suavemente y aplicar menos fuerza probablemente se solucionará este problema. Si el cirujano es raspado por la fuerza la punta del hueso, que causa una rotura en el hueso fino y dañar el cráneo. Por último, si después de adelgazamiento del hueso, el dura subyacente aparece magullado, es probablemente debido al exceso de calor de las vibraciones. Aumentando la tasa de flujo de la ACSF solucionará este problema.
La principal limitación del fasor es que la pieza de mano puede enrarecer el hueso, pero no puede quitar el hueso sobre la duramadre. La punta de diamante recubierto tiene pequeñas protuberancias ásperas. El roce necesario para diluir el cráneo sería desgastar la dura y causar sangrado si se utiliza para quitar el hueso. Así, el uso de fórceps es necesaria para eliminar la fina capa restante. Mientras que hay discusión en curso sobre si la proyección de imagen a través de un cráneo fina produce menos inflamación y menos proliferación de microglia y astrocitos reactivos, en algunos casos una ventana sin hueso restante es preferida, por ejemplo, para proporcionar una mayor profundidad de imagen3 .
Hemos optimizado la preparación de ventana craneal imagen multifotón en ratones. Fasor es, a nuestro conocimiento, la primera aplicación de la técnica piezoeléctrica a la cirugía de roedores ventana craneal para la proyección de imagen óptica. Encontramos que el uso de la cirugía piezoeléctrica en ratones comparte las ventajas del aumento de la velocidad y disminución de eventos adversos registrados también en los seres humanos7,8,9,10. Utilización del dispositivo piezoeléctrico dio lugar a cirugías más rápidas (figura 2A) y menos eventos adversos de sangrado comparado con una alta velocidad rotatoria del taladro (figura 2B). También encontramos, dentro de nuestro laboratorio, que fasor era más fácil para los nuevos cirujanos de aprender que los enfoques tradicionales para cirugía craneal ventana. Ventajas de la velocidad y facilidad de uso están probable que difieran entre los cirujanos. Preparaciones de cráneo fina requieren típicamente 30-45 min para adelgazar el hueso con un taladro y bisturí2, mientras que el enfoque de fasor normalmente requiere menos de 10 minutos.
Encontramos que en windows con FASORES podríamos imagen transitorios del calcio en neuronas piramidales de la capa 4 en la corteza de motor que habían sido transfectadas con virus adeno asociado codificación del indicador de calcio JRGECO1a (AAV9. Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40). también encontramos que, en comparación con una ventana craneal cráneo fino preparada con un taladro y un bisturí, la proyección de imagen de la región era más grande, mientras que un cráneo fino elaborado con un taladro y bisturí tiene una ventana de proyección de imagen de 20 μm de diámetro2 . Con FASORES, pudimos rápidamente fina una superficie de 3-4 mm. Esto es similar a la ventana de proyección de imagen divulgada con puertos4. Esta ventana más grande conserva el beneficio de la proyección de imagen rápida para windows delgada del cráneo con un taladro dental y bisturí. Además, la ventana con FASORES puede ser reflejada inmediatamente, en lugar de deshuese tradicional windows que requieran semanas para sanar antes de que la ventana puede ser óptimo imagen3.
Esta técnica puede aplicarse para estudiar alteraciones en el flujo sanguíneo en los vasos debajo de la duramadre. Un importante estudio es comparar el immunoreactivity de fasor con otros métodos de ventana craneal. Esto sería importante para determinar si el fasor produce menos inflamación en comparación con los métodos existentes. Esperamos que la técnica quirúrgica piezoeléctrica documentada aquí permitirá que más laboratorios realizar ventanas craneales y utilizar con éxito en vivola proyección de imagen multifotón.
Asegúrese de que la pieza de mano es vibrar en la posición más baja y que la ACSF es ser irrigado con una velocidad constante. El frío del hielo que se debe aplicar constantemente la ACSF o se calientan y dañar la duramadre. Encontramos que la ACSF debe aplicarse a una velocidad de al menos 1 mL/min puede utilizar una jeringa en la mano, o usar una bomba peristáltica, en lugar de la irrigación incorporada en la pieza de mano. El sistema de irrigación en la pieza de mano expulsa ACSF con demasiada fuerza y produce mucha turbulencia, lo que afectará significativamente la visibilidad.
The authors have nothing to disclose.
Tamara Zeric para ayudar a obtener la imagen multifotón en este papel. Apoyado por el cerebro y comportamiento, enfermedad de Parkinson y fundaciones JPB, R01 MH108186 y R01 DA07418. F31 beca 1F31MH109293-01A1 S c.
Piezosurgery Touch | Mectron | 5120062 | Piezosurgery GP model has the same settings |
Circular 4mm flat piezosurgery tip (# OT11) | Mectron | 3370019 | This tip was ideal for our windows but there are many other tips of different sizes availible. |
Stereotax frame | Kopf | 963 | |
Mouse adaptor | Stoelting | 51625 | |
Peristaltic pump for irrigation. | Cole-Parmer | WU-77120-42 | Makes it easier to irrigate and frees up the other hand to provide stability. Irrigation can be performed by hand with a syringe if necessary. |
Avitene Ultrafoam | Bard-Davol | 1050020 | Important to stop any minor bleeding instantly. |
C&B Metabond | Parkell | S380 | Much stronger than regular dental acrylic. |
Artificial cerebro spinal fluid (ACSF) | Tocris | 3525 | |
Puralube opthalmic ointment | Dechra | 17033-211-38 | |
Mice | JAX | 664 | |
Prairie Ultima multiphoton microscope | Olympus | ||
JRGECO1a (AAV9.Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40) | UPENN Vector Core |