Hier beschreiben wir eine Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) und ChIP-Seq Bibliothek Vorbereitung Protokoll zum globalen epigenomischen Profile aus Low-Fülle Huhn embryonalen Proben zu generieren.
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Methodenartikel
Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Protokoll für Low-Fülle embryonalen Proben
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) ist eine weit verbreitete Technik zur Kartierung der Lokalisierung von posttranslational modifizierte Histone, Histon-Varianten, Transkriptionsfaktoren oder Chromatin-modifizierende Enzyme, die an einen bestimmten Ort oder auf einer genomweiten Skala. Die Kombination von ChIP-Assays mit Next Generation Sequencing (z.B. ChIP-Seq) ist ein leistungsfähiger Ansatz weltweit genregulatorischer Netzwerke aufzudecken und die funktionale Anmerkung von Genomen, insbesondere von nicht-kodierenden regulatorischen Sequenzen zu verbessern. ChIP-Protokolle erfordern normalerweise große Mengen von Zellmaterial, damit die Anwendbarkeit dieser Methode zu untersuchen, seltene Zelltypen oder kleine Gewebebiopsien entgegensteht. Um die ChIP-Assay kompatibel mit der Menge des biologischen Materials vornehmen, die in der Regel in Vivo in der frühen Embryogenese vertebrate gewonnen werden können, beschreiben wir hier eine vereinfachte ChIP-Protokoll, in dem die Anzahl der Schritte erforderlich, um abzuschließen, die Assay wurden reduziert, um die Probenverlust zu minimieren. Dieses ChIP-Protokoll wird erfolgreich eingesetzt, um verschiedene Histon-Modifikationen in verschiedenen embryonalen und adulten Maus Geweben mit niedrigen bis mittleren Zellzahlen (5 x 104 - 5 x 105 Zellen) zu untersuchen. Wichtig ist, dieses Protokolls ist kompatibel mit ChIP-Seq-Technologie mit Standardbibliothek Zubereitungsmethoden, wodurch globale epigenomischen-Karten von hochaktuellen embryonalen Gewebe.
Einleitung
Post-translationalen Modifikationen der Histone sind verschiedene Chromatin-abhängige Prozesse, einschließlich Transkription, Replikation und DNA-Reparatur1,2,3direkt beteiligt. Darüber hinaus verschiedene Histon Änderungen zeigen positive (z. B. H3K4me3 und H3K27ac) oder negativ (z. B. H3K9me3 und H3K27me3) Korrelationen mit Genexpression und kann im großen und ganzen definiert als aktivierende oder repressive Histon markiert, bzw.2,3. Infolgedessen sind globale Histon Änderung Karten, auch bezeichn....
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Protokoll
nach den Richtlinien der deutschen Tierpflege, keine institutionelle Tier Pflege und Nutzung Committee (IACUC) Zulassung war notwendig, um das Huhn Embryo Experimente durchführen. Nach den lokalen Richtlinien genehmigungspflichtig nur Experimente mit HH44 (18 Tage) Hühnerembryos und ältere IACUC. In dieser Studie verwendeten Embryonen waren jedoch alle in früheren Stadien der embryonalen Entwicklung (d. h. HH19 (72 h)).
Hinweis: der Zweck dieses Protokolls ist eine detaillierte Beschreibung des ChIP-Tests liefern, so dass es mit qPCR oder Next Generation Sequencing (z.B. ChIP-Seq) zu untersuchen, Histon Änderungen effekt....
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Ergebnisse
Um die Leistung unserer ChIP-Protokoll zu veranschaulichen, haben wir ChIP-Seq-Experimente mit gepoolten SNT Abschnitte von HH19 Hühnerembryos, maxillaris Protuberanzen HH22 Embryonen, und Bühne-HH3 Hühnerembryos zu untersuchen, die verbindliche Profile von Huhn verschiedenen Histon-Modifikationen (z. B. H3K4me2, H3K27ac, H3K4me3 und H3K27me3). Das gewonnene ChIP DNAs waren wurde die Beschallung Effizienz durch Agarose-Gelelektrophorese der entsprechenden Eingabe DNAs (
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Diskussion
Epigenomischen Profilierung der Histon-Modifikation mit ChIP-Seq kann verwendet werden, zur Verbesserung der funktionellen Annotations vertebrate Genom in verschiedenen zellulären Kontexten4,5,18. Diese epigenomischen-Profile eingesetzt werden, unter anderem um zu identifizieren, Enhancer-Elemente, um die rechtliche Definition des Enhancer (d. h. aktiv, grundiert, oder bereit) und großen Zelle Identität Regulierungsbehö.......
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Offenlegungen
Die Autoren müssen keine finanzielle Interessenkonflikte offen gelegt werden.
Danksagungen
Die Autoren danken Jan Appel für seine hervorragende technische Unterstützung bei der Schaffung dieses Protokolls. Die Arbeit im Labor Rada-Iglesias stützt sich auf CMMC intramuralen Finanzierung, DFG Research Grants (RA 2547/1-1, RA 2547/2-1 und TE 1007/3-1), Gruppe der UoC fortgeschrittene Forscher Grant und CECAD Grant.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| ReagenzBSA-Pulver | |||
| Carl Roth | 3737.3 | ||
| Phosphat-Kochsalzpuffer (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Tris-HCL pH 8.0 | Sigma Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043.2 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.2 | |
| Na-Desoxycholat | Sigma Aldrich | D6750-24 | |
| N-Lauroylsarcosin | Sigma Aldrich | 61743-25G | |
| Hepes | Applichem | A3724,0250 | |
| LiCl | Carl Roth | 3739.2 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | I3021-100ml | |
| SDS | Carl Roth | 1833 | |
| Protein G/magnetische Kügelchen | Invitrogen | 1004D | |
| 37% Formaldehyd | Sigma Aldrich | 252549-1L | |
| Glycin | |||
| RNase | Peqlab | 12-RA-03 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | 46,35 E | |
| Na-Butyrat | Sigma Aldrich | ||
| Proteinase-Hemmer | Roche | 5892791001 | |
| SYBRgreen Mix | biozym | 617004 | |
| dH2O | Sigma Aldrich | W4502 | |
| 1 Kb Leiter | Thermofisher | SM1333 | |
| Orange G | Sigma Alrich | 03756-25 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 0,25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25200-072 | |
| Octylphenolethoxylat (Triton x 100) | Roth | 3051.4 | |
| DMEM (Dulbecco&akut; s Modified Eagle Medium) | Gibco | 31331-028 | |
| Gel-Ladespitzen Multiflex | A.Hartenstein | GS21 | |
| qPCR Platten | Sarstedt | 721.985.202 | |
| 384 well | Sarstedt | 721.985.202 | |
| 1,5 mL Röhrchen | Sarstedt | 72.706 | |
| 100 - 1.000 µ L Filterspitzen | Sarstedt | 70,762,211 | |
| 2 - 20 µ L Filterspitzen | Sarstedt | 70,760,213 | |
| 2 - 200 µ L Filterspitzen | Sarstedt | 70,760,211 | |
| 0,5 - 10 µ L Filterspitzen | Sarstedt | 701,116,210 | |
| H3K27me3 Antikörper | Active Motif | 39155 | |
| H3K27ac Antikörper | Active Motif | 39133 | |
| H3K4me3 Antikörper | Active Motif | 39159 | |
| H3K4me2 Antikörper | Active Motif | 39141 | |
| End Repair Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Paramagnetische Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Resuspensionspuffer | Illumina | FC-121-4001 | |
| A-Tailing Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Ligation Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| RNA Adapter Indexes | Illumina | RS-122-2101 | |
| Stop Ligation | Buffer Illumina | FC-121-4001 | |
| PCR-Primer-Cocktail | Illumina | FC-121-4001 | |
| Erweiterter PCR-Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Genomische DNA-Leiter | Agilent | 5067-5582 | |
| Elutionspuffer | Agilent | 19086 | |
| Probenpuffer | Agilent | 5067-5582 | |
| Bibliotheksquantifizierungskit | Kapa Biosystems | KK4835 – 07960204001 | |
| Fruchtbare Hühnereier | LSL Rhein Main | KN: 15968 | |
| Nadel (Neoject) | A.Hartenstein | 10001 | |
| Spritze (Ecoject 10 mL) | Dispomed witt oHG | 21010< | |
| strong>Name | Unternehmen< | strong>Katalognummer | Kommentare |
| Ausrüstung | |||
| Zentrifuge | Hermle | Z 216 MK | |
| Thermoshaker | ITABIS | MKR13 | |
| Sonicator | Active Motive | EpiShear Sonde Sonicator | |
| Sonicator | Diagenode | Bioruptor Plus | |
| Rotator | Stuart | SB3 | |
| Variables Volumen (5 – 1.000 μ L) Pipetten | Eppendorf | N/A | |
| Timer | Sigma | N/A | |
| Magnethalter | Thermo Fisher | DynaMag-2 12321D | |
| Tischspinner | Heathrow Scientific | Sprossenmischer | |
| LMS | VTX 3000L | ||
| Real-Time PCR Cycler | Roche | Light Cycler; Serial Nr.5662 | |
| PCR Cycler | Applied Biosystems | Gene Amp PCR System 9700 | |
| DNA- und RNA-Qualitätskontrollsystem | Agilent | Agilent 4200 TapeStation System | |
| Pinzette | Dumont | 5-Inox-H | |
| Perforierter Löffel | World Präzisionsinstrumente | 501997 |
Referenzen
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
- Wang, Z., Schones, D. E., Zhao, K.
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Nachdrucke und Genehmigungen
