Myelinating Oligodendrozyten fördern schnelle Aktionspotential Ausbreitung und neuronale überleben. Hier beschriebene ist ein Protokoll für Oligodendrozyt-spezifischen Ausdruck der fluoreszierende Proteine in organotypischen Gehirnscheiben mit nachfolgenden Zeitraffer Bildgebung. Darüber hinaus wird ein einfaches Verfahren zur Visualisierung von ungefärbten Myelin vorgestellt.
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Methodenartikel
Visualisierung und Live Imaging Oligodendrozyt Organellen in organotypischen Gehirnscheiben mit Adeno-assoziierten Virus und konfokale Mikroskopie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Nervenzellen setzen auf die elektrische Isolierung und trophischen Unterstützung der Myelinating Oligodendrozyten. Trotz der Bedeutung der Oligodendrozyten wurden die erweiterte Tools derzeit verwendet, um Neuronen, studieren nur teilweise getroffen auf Oligodendrozyt Forscher. Zelle typspezifische Färbung durch virale Transduktion ist ein sinnvoller Ansatz, live Organelle Dynamik zu studieren. Dieser Beitrag beschreibt ein Protokoll zur Visualisierung von Oligodendrozyt Mitochondrien in organotypischen Gehirnscheiben durch Transduktion mit Adeno-assoziierte Virus (AAV) mit Genen für mitochondriale gezielte fluoreszierende Proteine von transkriptionelle kontrolliert Das Myelin basic Protein Förderer. Freuen Sie sich auf das Protokoll zur Herstellung von organotypischen koronalen Maus Gehirnscheiben. Ein Verfahren für Zeitraffer-Aufnahmen von Mitochondrien dann folgt. Diese Methoden auf andere Organellen übertragen werden können und möglicherweise besonders hilfreich für das Studium Organellen in der Myelinscheide. Schließlich beschreiben wir eine leicht verfügbare Technik zur Visualisierung von ungefärbten Myelin in lebenden Scheiben durch Reflexion der konfokalen Mikroskopie (CoRe). Kern erfordert keine zusätzliche Ausrüstung und kann nützlich sein, um die Myelinscheide während der live-Aufnahme zu identifizieren.
Einleitung
Weißen Substanz des Gehirns besteht aus Nervenzellen Axone eingewickelt in Myelin, eine spezielle erweiterte Plasmamembran von Oligodendrozyten gebildet. Myelin ist für schnelle und zuverlässige Aktionspotential Ausbreitung und langfristiges Überleben der Markhaltige Axone erforderlich, und ein Verlust von Myelin kann neurologische Dysfunktion verursachen. Trotz ihrer großen Bedeutung sind die Eigenschaften von Oligodendrozyten weniger bekannte Neuronen und Astrozyten im Vergleich. Infolgedessen wurden weniger Werkzeuge für das Studium von Oligodendrozyten entwickelt.
Leben Sie Bildgebung von Zellorganellen, wie Mitochondrien, endoplasmatis....
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Protokoll
die hier beschriebenen Vorgänge von der norwegischen Tier Forschung Behörde genehmigt worden. Lieferanten und Bestellnummern für das Verbrauchsmaterial und andere erforderliche Ausrüstung gibt es in der Liste der Materialien am Ende des Dokuments.
1. Vorbereitung des organotypischen Scheiben
Hinweis: dieses Rezept nutzt zwei Maus-Welpen bei postnatalen Tag 7-9 (p7-9), die Ausbeute 24 organotypischen Scheiben aufgeteilt auf zwei sechs-Well Kultur Gerichte. Sofern nicht anders angegeben, alle Verfahren sollte in einem sterilen Abzug erfolgen und Nitril oder Latex-Handschuhe verwendet werden sollte. Nur Zelle Kultu....
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Ergebnisse
Organotypischen Gehirnscheiben, die kultiviert und ausgestrahlt, wie oben beschrieben wurden, zeigte eine spärliche Verteilung der kortikalen Oligodendrozyten mit dem Ausdruck Mito_dsred und GLP. Immunostaining mit Antikörpern gegen Olig2 und MBP bestätigte, dass der Ausdruck spezifisch für Oligodendrozyten (Abbildung 1).
Für live Aufnahmen wurden ausgestrahlt Oligodendrozyten durch ihre charakteris.......
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Diskussion
Das Protokoll zur Herstellung von organotypischen Kulturen hier beschrieben ist eine modifizierte Version18 des Protokolls von De Simoni und Yu (2006)5beschrieben. Die wichtigsten Änderungen sind nachfolgend dargelegt worden. TRIS-Puffer ist das Kulturmedium hinzugefügt, die das Überleben der Scheiben wenn außerhalb des Inkubators während virale Transduktion und Wechsel des Mediums Zelle verbessert. Die Sterilisation für Konfetti wird ebenfalls geändert. Während andere Prot.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Danksagungen
Wir danken Linda Hildegard Bergersen und Magnar Bjørås für den Zugang zu Handy-Lab und Ausrüstung, Janelia Molekularbiologie gemeinsame Ressource Personal für Plasmid und Virus-Produktion und Koen Vervaeke Unterstützung bei Lasermessungen macht. Diese Arbeit wurde von der norwegischen Health Association, der Norwegische Forschungsrat finanziert und die Mikroskopie-Ausrüstung wurde durch Norbrain finanziert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| BD Mikrolanze 19G | BD | 301500 | Nadeln für den Ein- und Auslass des Bades |
| Bioxidgas | AGA | 105701 | |
| Marke Pipettenbirnen | Sigma-Aldrich | Z615927 | Pipettenbirnen |
| Bunsenbrenner (Flüssigpropanbrenner) | VWR | 89038-530 | |
| Kabelkonfektion für Heizungsregler | Warner Instruments | 64-0106 | Temperaturregler - Thermometerteil |
| CaCl2 | Fluka | 21100 | |
| CO2 | AGA | 100309 | CO2 für Inkubator |
| Deckglas, quadratisch Corning | Thermo Fischer Scientific | 13206778 | Zur Befestigung unter der Badewanne für Live-Bildgebung. Mit Kleber oder Vaseline verschließen. |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | |
| Zarte Pinzette | Finescience | 11063-07 | Zum Sezieren |
| Diamant-Ritzstift | Ted Pella Inc. | 54463 | |
| Einweg-Glaspasteurpipetten 230 mm | VWR | 612-1702 | Glaspipetten |
| Doppelschneidige Rasierklinge aus Edelstahl | Elektronenmikroskopie Sciences | #7200 | Rasierklinge für Vibratome |
| Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | Gibco-Invitrogen | 24010-043 | |
| Filterpapierkreise | Schleicher & Schuell | 300,220 | Filterpapier zur Filtration von PFA |
| Fun Tack | Loctite | 1270884 | Zum Anschließen/Einstellen der Position von Ein- und Auslässen in der Badewanne |
| Handtuch C-Fold 2 | Katrin | 344388 | |
| Harfe, flach für RC-41 Kammer, | Warner Instruments | 64-1418 | Harfe, um Konfetti in der Badewanne festzuhalten. Schneiden Sie die Fäden vor der Verwendung mit organotypischen Scheiben ab. 1,5 mm, 13mm, SHD-41/15 |
| HEPES, FW: 260,3 | Sigma | H-7006 | |
| Holten LaminAir, Modell 1.2 | Heto-Holten | 96004000M | Laminar-Flow-Haube |
| Pferdeserum, hitzeinaktiviert | Gibco-Invitrogen | 26050-088 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LCR-Membran, PTFE, | Millipore | FHLC0130 | Konfetti |
| Leica VT1200 | Leica | 14048142065 | Vibratome |
| MEM-Glutamax mit HEPES | Thermo Fischer Scientific | 42360024 | |
| MgCl2 | R.P. Normapur | 25 108.295 | |
| Mikrolöffel Heyman Typ B | Elektronenmikroskopie | Sciences 62411-B | Kleiner, abgerundeter Spatel mit geschärftem Ende zum Sezieren |
| Millex-GP Filtereinheit | Millipore | SLGPM33RA | Spritzenfiltereinheit |
| Millicell Zellkultureinsatz, 30 mm | Millipore | PICM03050 | Zellkultureinsätze |
| Minipuls 3 Speed Control Module | GILSON | F155001 | Schlauchpumpe für Live-Imaging - Steuermodulteil (Anschluss an Zweikanalkopf) |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 | |
| Nunclon Delta Surface | Thermo Fischer Scientific | 140675 | Kulturplatte |
| Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638 | |
| Objektiv W "Plan-Apochromat" 40x/1,0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | Wasserimmersionsobjektiv für Live-Bildgebung. (WD=2.5mm), VIS-IR |
| Parafilm | VWR | 291-1211 | |
| Paraformaldehyd, granulat | Elektronenmikroskopie Sciences | #19208 | |
| PC-R Perfusionskammer | SiSkiYou | 15280000E | Bad für Live-Bildgebung |
| Penicillin-Streptomycin, flüssig | Invitrogen | 15070-063 | |
| Petrischale 140 mm | Heger | 1075 | Große Petrischale |
| Petrischale 92x16 mm; | Sarstedt | 82.1473 | Mittlere Petrischale |
| Petrischale 55x14,2 mm | VWR | 391-0868 | Kleine Petrischale |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Sigma | P4417 | PBS Tabletten |
| R2 Zweikanal-Kopf | GILSON | F117800 | Schlauchpumpe für Live-Imaging - Zweikanal-Kopfteil (Steuermodul erforderlich) |
| Rund-/Flachspatel, Edelstahl | VWR | 82027-528 | Großer Spatel zum Sezieren |
| Schleifpapier | VWR | MMMA63119 | Optional, zum Glätten von Glasscheren Pipetten |
| Schere, 17,5 cm | Finescience | 14130-17 | Große Schere zum Sezieren |
| Schere, 8,5 | Finescience | 14084-08 | Kleine, scharfe Schere zum Sezieren |
| Einschneidige, Edelsteinklinge | Elektronenmikroskopie Sciences | #71972 | Einschneidige Rasierklinge |
| Einfache Inline-Lösungsheizung SH-27B | Warner Instruments | 64-0102 | Temperaturregler - Heizteil |
| Steritop-GP Filtereinheit, 500 ml, 45mm | Millipore | SCGPT05RE | Filter zum Sterilisieren Lösungen |
| Sekundenkleber Präzision | Loctite | 1577386 | |
| Chirurgische Skalpellklinge Nr. 22 | Swann Morton Ltd. | 209 | Abgerundete Skalpellklinge |
| Temperaturregler TC324B | Warner Instruments | 64-0100 | Temperaturregler für Live-Bildgebung (erfordert Lösungsheizung und Kabelkonfektion) |
| Trizma-Basis | Sigma | T1503 | |
| Trizma HCl | Sigma | T3253 | |
| Inkubator mit Wassermantel Serie II | Forma Scientific | 78653-2882 | Inkubator |
Referenzen
- Barry, C., Pearson, C., Barbarese, E. Morphological organization of oligodendrocyte processes during development in culture and in vivo. Dev. Neursosci. 18, 233-242 (1996).
- Simpson, P. B., Mehotra, S., Lange, G. D., Russell, J. T.
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Nachdrucke und Genehmigungen
