Effiziente Erzeugung und Bearbeitung von Feeder-freie IPSCs aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse mit dem CRISPR-Cas9-System

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt im Detail die Generation der Fußabdruck-freie induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse in den Feeder-freien Bedingungen, gefolgt von Bearbeitung mit CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins und Charakterisierung der geänderten einzellige Klone.

Zusammenfassung

Embryonalen und induzierte pluripotente Stammzellen können selbst zu erneuern und in mehreren Zelltypen des Körpers differenzieren. Die pluripotenten Zellen sind somit für die Forschung in der regenerativen Medizin begehrt und werden derzeit in klinischen Studien für Augenerkrankungen, Diabetes, Herzkrankheiten und anderen Erkrankungen. Das Potential, sich in spezialisierte Zelltypen, gekoppelt mit der jüngsten Fortschritte im Genom Bearbeitung Technologien einschließlich der CRISPR/Cas-System differenzieren haben zusätzliche Möglichkeiten für die Anpassung des Genoms des iPSC für die verschiedensten Anwendungen zur Verfügung gestellt einschließlich der Krankheit Modellierung, Gentherapie, und Vorspannen Wege der Differenzierung, um nur einige zu nennen. Unter den verfügbaren Bearbeitungen Technologien hat CRISPR/Cas9 von Streptococcus Pyogenes als ein Werkzeug der Wahl für die standortspezifische Bearbeitung des eukaryotischen Genoms entstanden. Das CRISPR sind leicht zugänglich, kostengünstig und höchst effizient in technische gezielte Bearbeitungen. Das System benötigt einen Cas9-Nuklease und ein Führer-Sequenz (20-Mer) spezifisch für die genomische Ziel anschlagenden ein 3-Nukleotid "NGG" Protospacer-neben-Motiv (PAM) für die Ausrichtung der Cas9 auf die gewünschte genomischen Locus, neben einem universellen Cas9 Bindung Tracer RNA ( zusammengerufen einzelne Führer RNS oder SgRNA). Hier präsentieren wir Ihnen eine Schritt-für-Schritt-Protokoll für die effiziente Erzeugung von Feeder-unabhängig und frei von Fußabdruck iPSC und beschreiben Methoden für die Genom-Bearbeitung der iPSC mit Cas9 Ribonucleoprotein (RNP) komplexe. Das Genom Bearbeitung Protokoll ist effektiv und kann leicht durch Pre-Komplexbildner SgRNAs für mehr als ein Ziel mit dem Cas9 Protein und gleichzeitig in die Zellen liefern gemultiplext werden. Schließlich beschreiben wir einen vereinfachten Ansatz zur Identifizierung und Charakterisierung von iPSCs mit gewünschten Bearbeitungen. Zusammengenommen dürften die skizzierten Strategien zur Erzeugung und Bearbeitung von iPSC für vielfältige Anwendungen zu optimieren.

Einleitung

Die Neuprogrammierung der menschlichen Körperzellen zu pluripotenten Zustand durch Überexpression der Neuprogrammierung Faktoren hat Stammzellenforschung mit Anwendungen in der Krankheit Modellierung, regenerative Medizin und Arzneimittelentwicklung revolutioniert. Mehrere nicht-viralen Neuprogrammierung Methoden sind lieferbar Umprogrammierung Faktoren und iPSCs zu generieren, aber der Prozess ist Arbeit intensiv und nicht sehr effizient¹. Die virale Methoden sind zwar effizienter, mit Problemen der Virus Integration und Tumorigenität^2,3,4. In diesem ....

Protokoll

1. Umprogrammierung Protokoll

1. Generation von menschlichen iPSC aus primären menschlichen pankreatischen Zellen
   1. Mantel, ein 6-Well-Platte mit 1,5 mg/mL kalte Kollagen und lassen Sie es bei 37 ° C für 1 h Gel,
   2. Platte frühe Passage menschliche primäre Zellen der Bauchspeicheldrüse in Prigrow III Medium (~ 1-1,5 × 10 ⁵ Zellen) auf einer Kollagen 6-Well-Platte am Tag-2 beschichtet bis etwa 2,5 × 10 ⁵ Zellen oder mindestens 60 % zu erreichen confluency pro auch am Tag der Transduktion (Tag 0). Für die erste Studie Platte mindestens 2-3 Brunnen um einen Brunnen mit gewünschten Konfluenz am Tag 0 zu erhalten....

Ergebnisse

In dieser Publikation haben wir eine einfache, aber effiziente Protokoll für die Generation der iPSC aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse mit Integration oder Fußabdruck-kostenlose Sendai Virus Vektoren verfolgt. Abbildung 1A zeigt eine schematische Darstellung dieses Neuprogrammierung Protokolls. Die menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüsen waren kommerziell, erworben in Prigrow III Medium kultiviert und ausgestrahlt mit Sendai-Virus wie oben be.......

Diskussion

Umprogrammierung der menschlichen Körperzellen zu iPSCs hat einen wichtigen Impuls für die Felder der Grundlagenbiologie Forschung, personalisierte Medizin, Krankheit Modellierung, Arzneimittelentwicklung und regenerative Medizin¹⁶zur Verfügung gestellt. Viele aktuelle und am weitesten verbreitete Methoden der menschlichen iPSC Generation erfordern den Einsatz von Virus mit dem Risiko einer Integration in das Wirtsgenom oder episomal Vektoren mit geringer Effizienz Umprogrammierung. Hier präsentie.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Sendai virale Vektoren - CytoTune-iPS 2.0 Kit	Invitrogen	A16517	Auftauen auf Eis; S Nr.: 1
Trypsin EDTA	Gibco Life Tech	25300-054	0,05%, 100 ml; S Nr.: 2
Gesteinsinhibitor (Y-27632)	Milipore	SCM075	Verwendung 10 μ M; S Nr.: 3
DMEM/F-12 Medium	Invitrogen	11330-032	S Nr.: 4
Serumersatz (KSR)	Gibco	10828028	S Nr.: 5
DMEM	Invitrogen	11960069	1X; S Nr.: 6
Fötales Rinderserum	Thermo Scientific	SH30071.03	Aliquot; S Nr.: 7
L-Glutamin (Glutamax, 100X), flüssig	Thermo Scientific	35050061	1/100; S Nr.: 8
nicht-essentielle Aminosäuren	Gibco	11140-050	1/100; S Nr.: 9
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	55 mM, 1/1.000; S Nr.: 10
Hausser Hämazytometer	Hausser Scientific	02-671-54	S Nr.: 11
0,1% Gelatinelösung	STEMCELL Technologies	7903	Inkubieren bei 37º C für 1 Stunde; S Nr.: 12
SSEA-4 Antikörper	Santacruz	sc-21704	1/100; S Nr.: 13
TRA-1-81	Antikörper-Zell-Signalisierung	4745S	1/200; S Nr.: 14
OCT4 Antikörper	Santa Cruz	sc-5279	1/1.000; S Nr.: 15
Kollagen I, Rat Tail	Life Technologies	A10483-01	Kalt halten; S Nr.: 16
Alexa Fluor fluoreszierend 488/ 568 (Sekundärantikörper)	Invitrogen	A21202/A10042	1/2.000; S Nr.: 17
DPBS	Hyclone	SH30028LS	1X; S Nr.: 18
100-mm-Gewebekulturschale	Falcon	353003	S Nr.: 20
96-Well-Gewebekulturplatte	Falcon	353078	S Nr.: 21
6-Well-Gewebekulturplatte	Falcon	353046	S Nr.: 22
Präparierzielfernrohr	Nikon	SMZ745	S Nr.: 23
Zupfhaube	NuAire	NU-301	S Nr.: 24
15  ml Zentrifugenröhrchen	Greiner Bio-One	188271	S Nr.: 25
50  ml Zentrifugenröhrchen	Greiner Bio-One	227261	S Nr.: 26
Natriumpyruvat	Invitrogen	11360	S Nr.: 28
β-mercaptoethanol	Sigma	M7522	S Nr.: 29
Prigrow III medium	ABM	TM003	S Nr.: 31
Countess™ Zellzähler	Invitrogen	C10227	S Nr.: 32
Faxitron Röntgensystem	Faxitron	CellRad	S Nr.: 33
Accutase	Innovative cell Technologies	AT-104	S Nr.: 34
Collagenase	Life Technologies	17104019	1mg/ml Lagerbestand; S Nr.: 35
Dispase	STEMCELL Technologies	7923	S Nr.: 36
hESC qualifiziertes Matrigel	BD Biosciences	354277	Zum Verdünnen kaltes DMEM/F-12 verwenden; S Nr.: 37
bFGF	R & D	233-FB	Schaft 10 μg/ml; S Nr.: 38
Paraformaldehyd	EMS	15710	4% Lagerbestand an PBS; S Nr.: 39
TRA-1-60	Santa Cruz	sc-21705	1/100; S-Nr.: 40
NANOG	ReproCELL	RCAB0004P-F	1/100; S Nr.: 41
Tween 20	Sigma	P9416-100ML	S Nr.: 42
Alkalisches Phosphatase-Kit	Stemgent	00-0055	S Nr.: 43
Cas9-Protein	PNA Bio	CP01-50	Auftauen und Aliquot; S Nr.: 44
Ziegen- oder Eselserum	Sigma	D9663/G9023	S Nr.: 45
Triton X-100	Sigma	X100-100ML	S Nr.: 46
DAPI	Thermo Scientific	D1306	S Nr.: 47
Tris	Sigma	9285-100ML	S Nr.: 48
NaCL	Sigma	S7653-250G	S Nr.: 49
	EDTA Sigma	BP2482-500	S Nr: 50
T4 DNA-Ligase	NEB	M0202T	S Nr.: 51
Mega Shortscript T7 Kit	Thermo Scientific	AM1354	S Nr.: 52
Mega Clear Kit	Thermo Scientific	AM1908	S Nr.: 53
SMC4	BD Biosciences	354357	S Nr.: 54
Fibronektin	STEMCELL Technologies	7159	S Nr.: 55
CloneJET Klonierungskit	Thermo Scientific	K1232	S Nr.: 56
FragmentanalysatorTM	Advanced Analytical		S Nr.: 57
mTeSR1 Medium Kit	STEMCELL Technologies	5850	Warm bis Raumtemperatur; S Nr.: 58
Gefriermedium mFreSR™	STEMCELL Technologies	5855	S Nr.: 59
Gefriermedium CryoStor®	STEMCELL Technologies	7930	S Nr.: 60
MEFs	Globalstem	GSC-6301G	S Nr.: 61
L-Glutamin	Invitrogen	25030081	S Nr.: 62
Menschliche Pankreaszellen	ABM	T0159	S Nr.: 63
STEMdiff™ Neuronales Induktionsmedium	Stemcell Technologies	5835	S Nr.: 64
RPMI	Thermofisher	11875-093	S Nr.: 65
2% B27-Insulin	Thermofisher	A1895601	S Nr.: 66
CHIR99021	Stemcell Technologies	72052	S Nr.: 67
IWP4	Stemcell Technologies	72552	S Nr.: 68
2% B27	Thermofisher	17504044	S Nr.: 69
MCDB 131	Life Technologies	10372019	Nr.: 70
Natriumbicarbonat	Sigma-Aldrich	S8761-100ML	S Nr.: 71
Glukose	Sigma-Aldrich	G8270-100G	S Nr.: 72
BSA	Proliant	68700	S Nr.: 73
GDF8	Pepro-Tech	120-00	S Nr.: 74
TUJ1 Antikörper	EMD Milipore	AB9354	S Nr.: 75
NKX2-5 Antikörper	Santa Cruz	Sc-14033	S Nr.: 76
SOX17 Antikörper	R & D systems	AF1924	S Nr.: 77
Propidiumiodid	Thermo Scientific	P3566	S Nr.: 78
Amaxa 4D-Nukleofektor™	Lonza	AAF-1002	S Nr.: 79
FACSAria II (Zellsortierer)	BD biosciences	SORP UV	S Nr.: 80