Summary

Synthèse et évaluation d’un inhibiteur de l’absorption de Calcium mitochondrique axée sur le ruthénium

Published: October 26, 2017
doi:

Summary

Un protocole pour la synthèse, purification et caractérisation d’un inhibiteur de ruthénium-basée de la capture de calcium mitochondrique est présenté. Une procédure pour évaluer son efficacité dans les cellules de mammifères perméabilisées est démontrée.

Abstract

Nous détaillons la synthèse et la purification d’un inhibiteur de l’absorption de calcium mitochondrique, [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)]5 +. La synthèse optimisée de ce composé commence à partir de [Ru (NH3)5Cl] Cl2 en 1 M NH4OH dans un récipient fermé, ce qui donne une solution verte. Purification s’effectue par chromatographie échangeuse de cations. Ce composé est caractérisé et vérifié comme pure par spectroscopie UV-visible et IR. Les propriétés inhibitrices de l’absorption de calcium mitochondrique sont évaluées dans les cellules HeLa perméabilisées par spectroscopie de fluorescence.

Introduction

Le calcium mitochondrique est un régulateur clé pour un certain nombre de processus qui sont essentielles à la fonction des cellules normales, y compris la production d’énergie et de l’apoptose. 1 , 2 , 3 le calcium mitochondrique Uniport (MCU), une protéine de transport des ions qui se trouve dans la membrane mitochondriale interne, réglemente l’influx des ions calcium dans les mitochondries. 4 , 5 , 6 les inhibiteurs chimiques de la MCU sont des outils précieux pour la poursuite des efforts pour étudier la fonction et les rôles cellulaires de ce transport des protéines et le calcium mitochondrique. Le composé [(HCO2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, est un des seuls inhibiteurs sélectifs connus pour le MCU avec une valeur déclarée ded K de 24 µM.7 ,8,9,10 , ce complexe est une impureté commune trouvée dans les formulations commerciales de rouge de ruthénium (RuRed), un triruthenium di-µ-oxo ponté hexacation de la formule [(NH3) 5 RU (µ-O) Ru (NH3)4(µ-O) Ru (NH3)5)]6 +, qui a également été utilisé comme un inhibiteur de l’absorption du calcium. Ru360 est disponible dans le commerce, mais il est très coûteux. En outre, la synthèse et l’isolement des Ru360 est contestée par les procédures de purification difficile et méthodes de caractérisation ambiguë.

Nous avons récemment rapporté les procédures alternatives pour accéder à un Ru360 analogique, [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5. 11 ce composé inhibe la MCU avec l’affinité élevée, similaire à Ru360. Dans ce protocole, nous décrirons notre synthèse plus efficace de ce composé, qui commence à partir de [Ru (NH3)5Cl] Cl2. Purification du produit à l’aide de résine échangeuse de cations fortement acide est détaillée, ainsi que les pièges communs pour cette procédure. Aussi, nous présentons des méthodes de caractérisation et d’évaluation de pureté composée et délimiter une approche simple pour tester son efficacité en bloquant l’absorption calcique mitochondriale.

Protocol

Remarque : acides concentrés et bases sont utilisées dans la présente synthèse. Utilisez toutes les pratiques de sécurité qui s’imposent lors de l’exécution de la réaction, y compris l’utilisation des contrôles d’ingénierie (hotte aspirante) et équipement de protection individuelle (EPI) y compris les lunettes de protection, gants, blouse, pleine longueur pantalons et chaussures fermées. 1. préparation de [(OH 2) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4</…

Representative Results

Cette méthode décrit une synthèse du calcium mitochondrial absorption inhibiteur [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 à partir de [Ru (NH3)5Cl] Cl2, une matériel de départ bien connu de ruthénium (III). [Ru (NH3)5Cl] CL2 est caractérisés par spectroscopie IR, avec des modes de vibration à 3200 cm-1, 1608 cm-1, …

Discussion

Le calcium mitochondrial absorption inhibiteur [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 peut être synthétisé de [Ru (NH3)5Cl] Cl2, un bien connu ruthénium à partir de matériel, tel que décrit dans cette procédure. La synthèse de [Ru (NH3)5Cl] Cl2 est facilement atteint sans trop de difficulté. Après agitation RuCl3 pendant 16 h dans l’hydrazine hydrate, l…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette recherche a été financée par l’Université Cornell. Ce travail fait usage du centre Cornell pour matériaux recherche Shared Facilities, qui sont pris en charge par le programme NSF MRSEC (Grant DMR-1120296). S.R.N. reconnaît la prise en charge par une bourse de recherche universitaire de la NSF (subvention DGE – 1650441) et Dr. Dave Holowka d’assistance avec les expériences de calcium. Opinions, résultats et conclusions ou recommandations exprimées dans ce matériel sont celles de l’auteur (s) et ne reflètent pas nécessairement les vues de la National Science Foundation.

Materials

Ruthenium Trichloride hydrate Pressure Chemical 3750
Concentrated hydrochloric acid J.T. Baker 9535
Concentrated ammonium hydroxide Mallinckrodt Chemical Works A669C-2 1
Dowex 50 WX2 200-400 Mesh Alfa Aesar 13945
Calcium Green 5N Invitrogen C3737
Digitonin Aldrich 260746
DMSO Aldrich 471267
EGTA Aldrich E3889
KCl USB 20598
KH2PO4 Aldrich P3786
MgCl2 Fisher Scientific M33-500
HEPES Fluka 54466
Sodium Succinate Alfa Aesar 33386
EDTA J.T. Baker 8993-01
Glucose Aldrich G5000
200 Round bottom flask ChemGlass CG-1506-14
Glass stopper ChemGlass CG-3000-05
10 mm x 15 cm glass column with reservoirs Custom – similar to Chemglass columns Similar to CG-1203-20
DMEM Corning 10-017-CV
FBS Gibco 10437028
PBS Corning 21-040-CV
Round bottom Falcon tubes Fisher Scientific 14-959-11B 
500 cm2 petri dishes Corning 431110
Trypan blue ThermoFisher Scientific 15250061
Hemacytometer Aldrich Z359629
Acrylic Cuvettes VWR  58017-875
UV-Vis spectrometer Agilent Model Cary 8454 
Spectrofluorimeter SLM Model 8100C
IR spectrometer Bruker Hyprion FTIR with ATR attachment
Centrifuge ALC Model PM140R
Inverted light microscope VWR  89404-462

Referenzen

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  8. Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -. L., Sanadi, D. R. The component of “ruthenium red” responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of µ-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3. J. Am. Chem. Soc. 115 (25), 11799-11805 (1993).
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Diesen Artikel zitieren
Nathan, S. R., Wilson, J. J. Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor. J. Vis. Exp. (128), e56527, doi:10.3791/56527 (2017).

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