Wir präsentieren Ihnen eine effektive und reproduzierbare Methode zum isolieren und Kultur neurale Vorläuferzellen aus embryonalen und postnatale Hirngewebe für Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) von Histon 3 Lysin 79 Dimethylation (H3K79me2) - eine Histon-Markierung befindet sich innerhalb der globulären Domäne des Histon 3.
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Methodenartikel
Isolierung und Kultivierung von neuronalen Vorläuferzellen gefolgt von Chromatin Immunopräzipitation Histon 3 Lysin 79 Dimethylation Marke
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Entwicklung des Gehirns ist ein komplexer Prozess, der in gewissem Sinne Temporo-räumliche von Steigungen von Morphogens und verschiedene transkriptionelle Programme gesteuert wird. Darüber hinaus haben die epigenetische Chromatin Modifikationen, wie Histon-Methylierung, für Aufbau und Pflege von bestimmten Zelle Schicksale in diesem Prozess eine wichtige Rolle. Die überwiegende Mehrheit der Histon-Methylierung tritt auf die flexible Histon-Schweif, die Histon-Modifikatoren, Radiergummis und Histonproteine Leser zugänglich ist. Im Gegensatz dazu H3K79 Methylierung befindet sich in der globulären Domäne von Histon 3 und ist in verschiedenen Entwicklungsstörungen Funktionen beteiligt. H3K79-Methylierung ist evolutionär konserviert und finden in den unterschiedlichsten Arten von Homo Sapiens zu Saccharomyces Cerevisiae. Die Änderung tritt in unterschiedlichen Zellpopulationen innerhalb von Organismen, einschließlich des neuronalen Vorläuferzellen. Die Lage der H3K79-Methylierung in der globulären Domäne von Histon 3 macht es schwierig zu beurteilen. Hier präsentieren wir Ihnen Methoden, zu isolieren und Kultur kortikalen Progenitor Zellen (CPCs) aus embryonalen kortikalen Hirngewebe (E11.5-E14.5) oder zerebelläre granulare Neuron Stammväter (CGNPs) vom postnatalen Gewebe (P5-P7) und effizient immunoprecipitate H3K79me2 für quantitative PCR (qPCR) und genomweite Sequenzierung.
Einleitung
Die sensorischen, motorischen und kognitiven Funktionen des Gehirns sind hoch komplex und anfällig für körperliche und ökologischen Veränderungen. Das Gehirn besteht aus drei allgemeine Teile der Hind-, Mittel-, und Vorderhirn, die zutiefst verbunden sind. Im Vorderhirn kann das Telencephalon in einer dorsalen Telenzephalon (DT) und einer ventralen Telencephalon (VT) unterteilt werden. Die DT von Mäusen besteht aus sechs kortikalen Schichten, die zwischen E11.5 und E18.5 in einer Art und Weise der "Inside-Out"1gebildet werden. Der VT umfasst die ganglionic Eminenzen in Entwicklung, die später die Basalganglien2,
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Protokoll
Tierschutz Ausschüsse der Universität Freiburg und lokalen Behörden genehmigt alle Tierversuche (G12/13, G16/11) in das folgende Protokoll erwähnt.
1. Vorbereitungen
-
Vorbereitungen für die CPCs Isolierung
- Richten Sie zeitgesteuerte Paarung um Embryonen in verschiedenen Entwicklungsstadien Kortex (zwischen E11.5 und E14.5) zu erhalten. Verwenden Sie Mäuse des Stammes NMRI (Naval Medical Research Institute), die mindestens 8 Wochen alt sind. Betrachten Sie nach der Paarung einen positiven vaginalen Stecker am E0.5.
- Um genügend Material haben, verwenden Sie einen Wurf NMRI Mäuse für ein H3K79me2....
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Ergebnisse
Allgemeine Systematik der neuronalen Vorläuferzellen Isolation, Anbau, H3K79me2 ChIP und ChIP-Analyse-Methoden: Abbildung 1 zeigt ein Flussdiagramm H3K79me2 ChIP der kortikalen Vorläuferzellen zu verschiedenen Zeitpunkten während der Entwicklung des embryonalen Gehirns oder zerebelläre granulare Neuron Stammväter in postnatale Phasen durchführen. Als ersten Schritt das Gehirn isoliert werden und das Telencephalon (zwischen E11.5 und E14.5) od.......
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Diskussion
Es gibt zwei große Möglichkeiten, um führen Sie Chromatin Immunopräzipitation um die genomische Belegung der Histon-Modifikationen, Transkriptionsfaktoren, Histon-Code-Leser, Autoren oder Radiergummis zu erkennen. Eine ist die native ChIP-Methode mit Nuklease verdaut, native Chromatin für Immunopräzipitation, und die andere ist die vorgestellte Methode mit PFA-repariert, abscherend Chromatin, in dem die Nukleosomen und andere DNA-attached Proteine kovalent an die DNA gebunden sind 39. native ChIP .......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte
Danksagungen
Wir danken für die Unterstützung der CGN-Anbau-Protokoll im Labor herstellen Henriette Bertemes. Dieser Methode Papier wurde von der DFG-geförderten CRC992 medizinische Epigenetik unterstützt, durch die Finanzierung zu TV. Die Autoren erkennen die Unterstützung von Freiburg Galaxy Team: Pavankumar Videm, Björn Grüning und Prof. Rolf Backofen, Bioinformatik, Universität Freiburg, Deutschland finanziert Collaborative Research Center 992 medizinische Epigenetik (DFG Stipendium SFB 992/1 2012) Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF Grant 031 A538A RBC (de.) NBI)).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Anti-GAPDH | Abcam | ab8245 | Category: Antibody Abkürzung/Comment: Immunoblot Verdünnung 1:5000 |
| Anti-H3 | Abcam | ab1791 | Category: Antikörper Abkürzung/Kommentar: Immunoblot Verdünnung 1:3000 |
| Anti-H3K79me2 | Diagenode | pAb-051-050< | strong>Category: Antibody Abkürzung/Comment: ChIP Antikörper |
| Anti-H3K79me2 | Abcam | ab-051-050 | > Antibody Abkürzung/Comment: Immunoblot Verdünnung 1:1000 |
| Anti-Kaninchen-IgG | Diagenode | C15410206 | Category: Antibody Abkürzung/Comment: ChIP Ctrl Antikörper |
| Anti-Tubulin alpha | Abcam | ab108629 | Category: Antibody Abkürzung/Comment: Immunoblot Verdünnung 1:3000 |
| Apo-Transferrin (1 mg/ml) | Sigma-Aldrich | T1147 | Category: Cell culture Abkürzung/Kommentar: Für CCM |
| B27 Supplement (50x) | Life Technologies | 17504044 | Category: Cell culture Abkürzung/Kommentar: Für CCM |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2940CA | Category: ChIP Abkürzung/Comment: Für die Analyse von geschertem Chromatin |
| Bioruptor NextGen | Diagenode | B01020001 | Category: ChIP Abkürzung/Comment: Ultraschallgerät |
| Borsäure pH 8,4 | Sigma Aldrich | B6768 | Category: Cell culture Abkürzung/Comment: Für die CPC-Kultivierung |
| CFX Connect RT PCR Detection System | Bio-Rad | 1855201 | Category: ChIP Analysis Abkürzung/Kommentar: Nachweissystem für qPCR |
| DMEM-F12 | Life Technologies | 11320-033 | Category: Cell culture Abkürzung/Kommentar: Für CGM |
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10001D | Category: ChIP Abkürzung/Comment: Magnetische Kügelchen, für ChIP |
| EPZ-5676 | Selleckchem | S7062 | Category: DOT1L Inhibition Abkürzung/Comment: Für die DOT1L-Hemmung in Zellkulturen |
| Ethylendiamin Tetraessigsäure | SERVA | 39760.01 | Category: ChIP Abkürzung/Kommentar: EDTA |
| Fötales Rinderserum 10% (v/v) | Gibco | 10082147 | Category: Cell culture Abkürzung/Comment: Für CPC-Isolierung und CGM |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767< | strong>Category: Cell culture Abkürzung/Kommentar: Für CGNP-Isolierung |
| Glutathion (1,25 mg/ml) | Sigma-Aldrich | G4251 | Category: Cell culture Abkürzung/Comment: Für CCM |
| Glycine | Carl Roth | 3187 | Category: ChIP Abkürzung/Comment: Für die Zellfixierung |
| GoTaq Mastermix | Promega | A6002 | Category: ChIP Analysis Abkürzung/Kommentar: DNA-Polymerase-Mastermix für qPCR |
| Hank' s Balanced Salt Solution Life | Technologies | 14025-100< | strong>Category: Cell culture Abkürzung/Comment: HBSS |
| L-Glutamin (200 mM) | Life Technologies | 25030081 | Category: Cell culture Abkürzung/Kommentar: Für CCM |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Category: Cell culture Abkürzung/Comment: Für die CPC-Kultivierung |
| Lithiumchlorid | Sigma-Aldrich | L4408 | Category: ChIP Abkürzung/Comment: LiCl |
| N2 Ergänzung | Life Technologies | 17502048 | Category: Cell culture Abkürzung/Comment: Für CGM |
| NanoDrop 3300 | Thermo Fisher | 3300 | Category: ChIP Abkürzung/Kommentar: Fluorostrometer für die DNA-Quantifizierung |
| NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit für Illumina | NEB | E7645S | Category: ChIP Analysis Abkürzung/Comment: Kit für die Bibliotheksvorbereitung |
| NEBNext Multiplex-Oligos für Illumina | NEB | E7335 | Category: ChIP Analysis Abkürzung/Comment: Oligos für die Bibliotheksvorbereitung |
| Neurobasales Medium | Gibco | 21103049 | Category: Cell culture Abkürzung/Comment: Für CCM |
| NP-40 Alternative | Calbiochem | 492016 | Category: ChIP Abkürzung/Kommentar: Für ChIP-Puffer |
| Paraformaldehyd | Carl Roth | 335 | Category: ChIP Abkürzung/Comment: PFA, für die Zellfixierung |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin 1% (v/v) | Life Technologies | 15640055 | Category: Cell culture Abkürzung/Comment: PSN, für CCM und CGM |
| Phosphat gepufferte Kochsalzlösung | Life Technologies | 10010023 | Category: Cell culture Abkürzung/Comment: PBS, für die CPC-Isolierung |
| PicoGreen Kit | Thermo Fisher | P11496 | Category: ChIP Analysis Abkürzung/Comment: Visualisierung von Farbstoff für die DNA-Quantifizierung |
| Poly-D-Lysin | Sigma-Aldrich | P6407 | Category: Cell culture Abkürzung/Comment: Für die CGNP-Isolierung |
| Poly-L-Ornithin-Hydrobromid | Sigma Aldrich | P3655< | strong>Category: Cell culture Abkürzung/Comment: Für die CPC-Kultivierung |
| Kaliumchlorid | Thermo Fisher | AM9640G | Category: Cell culture Abkürzung/Comment: KCl, für CGM |
| Proteasehemmer | Roche | 4693159001 | Category: ChIP Abkürzung/Comment: Für ChIP |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | 3115879001 | Category: ChIP Abkürzung/Comment: Für ChIP |
| Qiagen MinElute | Qiagen | 28004 | Category: ChIP Abkürzung/Comment:Kit für die DNA-Aufreinigung |
| RNAse | Sigma-Aldrich | R6513 | Category: ChIP Abkürzung/Kommentar: Für ChIP |
| SGC0946 | Selleckchem | S7079 | Category: DOT1L inhibition Abbreviation/Comment: Für DOT1L-Hemmung in Zellkulturen |
| Natriumbicarbonat | Carl Roth | 8551.1 | Category: ChIP Abkürzung/Kommentar: für Elutionspuffer |
| Natriumchlorid | Carl Roth | 9265 | Category: ChIP Abkürzung/Comment: NaCl, für ChIP-Puffer |
| Natriumdesoxycholat | Sigma-Aldrich | 30970 | Category: ChIP Abkürzung/Comment: Für ChIP |
| Natrium Dodecylsulfat | Carl Roth | 183 | Category: ChIP Abkürzung/Comment: SDS, für ChIP |
| Sonic hedgehock (SHH) | Sigma-Aldrich | SRP6004 | Category: Cell culture Abkürzung/Kommentar: Für die CGNP-Isolierung |
| Superoxiddismutase (1mg/ml) | Sigma-Aldrich | S7571 | Category: Cell culture Abkürzung/Comment: Für CCM |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethan | Carl Roth | 9090 | Category: ChIP Abkürzung/Comment: TRIS, für ChIP-Puffer |
| Triton X-100 | Carl Roth | X100 | Category: ChIP Abkürzung/Comment: Für ChIP-Puffer |
| Trypsin-EDTA 0,05% (w/v) | Sigma Aldrich | 59417C | Category: Cell culture Abkürzung/Comment: Für CPC-Isolierung |
| Tween20 | Carl Roth | 28320 | Category: ChIP Abkürzung/Comment: Zur Präparation von Kügelchen |
| Weitere Laborgeräte: Neubauer-Zählkammer, Inkubator, Rotator, Shaker, Dissektionsset, Wasserbad | |||
| CCM: Kortikales Zellmedium | |||
| CGM: CGNP-Zellkulturmedium |
Referenzen
- Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat. Rev. Neurosci. 8, 427-437 (2007).
- Kandel, E. R., Squire, L. R. Neuroscience: breaking down scientific barriers to the study of brain and mind. Science....
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Nachdrucke und Genehmigungen
