Das Ziel dieses Protokolls ist, ex Vivo Drosophila Larven Gehirn Kultur so optimiert, dass circadiane molekulare Rhythmen mit langfristigen Zeitraffer Fluoreszenz-Bildgebung überwachen zu etablieren. Die Anwendung dieser Methode auf pharmakologische Tests wird auch diskutiert.
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Methodenartikel
Einzellige Auflösung Fluoreszenz Imaging von Drosophila zirkadiane Uhren in Larven Gehirn Kultur Leben
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die zirkadianen Schrittmacher-Schaltung orchestriert rhythmische Verhaltens- und physiologischen Ausgänge mit ökologischen Hinweise, wie Tag/Nacht-Zyklen abgestimmt. Die molekulare Uhr innerhalb jedes Neuron Herzschrittmacher erzeugt zirkadianen Rhythmen in der Genexpression, die die rhythmischen neuronalen Funktionen wesentlich für den Betrieb der Schaltung zugrunde liegen. Untersuchung der Eigenschaften der einzelnen molekulare Oszillatoren in verschiedenen Unterklassen der Herzschrittmacher Neuronen und deren Zusammenspiel mit neuronalen Signal ergibt ein besseres Verständnis der zirkadianen Schrittmacher-Schaltung. Hier präsentieren wir Ihnen einen Zeitraffer-Fluoreszenz-Mikroskopie-Ansatz entwickelt, um die molekularen Uhrwerk in Uhr Neuronen des kultivierten Drosophila Larven Gehirn zu überwachen. Diese Methode ermöglicht die mehrtägige Aufzeichnung von den Rhythmen der genetisch codierten fluoreszierende circadiane Reporter bei einzelligen Auflösung. Dieses Setup ist kombinierbar mit pharmakologische Manipulationen zu Echtzeit-Reaktion der molekularen Uhr zu verschiedenen Verbindungen genau analysieren. Über zirkadianen Rhythmen bietet diese multifunktionale Methode in Kombination mit leistungsstarken Drosophila genetische Techniken die Möglichkeit verschiedene neuronale oder molekulare Prozesse in live Hirngewebe zu studieren.
Einleitung
Zirkadiane Uhren helfen Organismen zur Anpassung an die periodischen Veränderungen der Umwelt durch die 24-Stunden-Rotation der Erde erzeugt. Interlock transkriptionelle translationale Rückkopplungsschleifen unterliegen häufig der molekulare Maschinerie der zirkadianen Taktgeber über Arten1. Die zirkadianen Schrittmacher-Schaltung, bestehend aus Uhr-haltigen Neuronen integriert-Uhrzeit-Informationen vermittelt durch die Umwelt-Signale, wie hell/dunkel (LD) und Temperaturzyklen, die Rhythmen von einer Vielzahl von täglich zu orchestrieren physiologischen und Verhaltensstörungen Prozesse2,3
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Protokoll
1. Vorbereitung der Stammlösungen unter einem Kultur-Haube
- Bereiten Sie 400 mL 1 x Schneider aktives Medium (SAM) optimiert für ex-Vivo -Kultur der Larven Gehirne (geändert von Referenz-24,-25) (Tabelle 1). Aliquot 5 mL und Blitz Einfrieren in flüssigem Stickstoff (LN2), Lagerung bei - 80 ° C.
- Bereiten Sie 1 x Dissecting Kochsalzlösung (DSS) durch Verdünnung 10-fach-Stammlösung (geändert von Referenz-26) (Tabelle 2).
- Aliquoten Fibrinogen, 10 mg und bei 4 ° C für den einmaligen Gebrauch.
Achtung: Wiege....
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Ergebnisse
Hier zeigen wir die repräsentativen Ergebnisse der langfristigen Aufnahme eines circadianen fluoreszierende Reporter in ex Vivo Larven Gehirn Kultur und bildgebenden Liveergebnisse PDF Bad Anwendung auf Reporter Ausdruck.
Non-wandering L3-Larven Ausdruck der molekularen Uhr Reporter pro-TDT und FH-mCD8::YFP, angetrieben von einem Uhr-Neuron-Fahrer Clk 856-gal4 (Abbildung 1) wurden .......
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Diskussion
Hier haben wir die Methode zur langfristigen Zeitraffer Fluoreszenzmikroskopie kultivierten Larven Gehirne beschrieben. Der Erfolg dieser Art von Experimenten hängt von mehreren Faktoren ab, wie die Gesundheit der Kultur, Methode zur Immobilisierung des Gehirns Explant, Fluoreszenzintensität und Signal-Rausch-Verhältnis der Reporter, zeitliche und räumliche Auflösung und Zugänglichkeit zu den Explant. Diese Faktoren können sich gegenseitig ausschließen. Zum Beispiel Zeitraffer Häufigkeit beeinflusst die Gesundheit der Ku.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Wir danken Michael Rosbash für seine Betreuung und Unterstützung während der Anfangsphase der Entwicklung dieser Methode. Diese Arbeit wurde vom JST PRESTO-Programm des Schweizer Nationalfonds (31003A_149893 und 31003A_169548), der Europäische Forschungsrat (ERC-StG-311194), Novartis Stiftung für medizinisch-biomedizinische Forschung (13A39) und der Universität Genf finanziert. .
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | Ich bin mir nicht sicher, ob es genau die gleichen sind, die wir im Labor haben. Wann immer verfügbar, habe ich "geeignet für Insektenzellkultur" gewählt |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, | C7902 | |
| MgSO4.7H2O, | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, | S5761 | |
| D-(+) Glukose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Hefeextrakt | Sigma-Aldrich | Y1000 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| BIS-TRIS | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| L-(−)-Apfelsäure | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| D-(+)-Trehalose-Dihydrat | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Bernsteinsäure | Sigma-Aldrich | S9512 | |
| Fumarsäure | Sigma-Aldrich | F8509 | |
| α-Ketoglutarsäure | Sigma-Aldrich | K1128 | |
| Nicht hitzeinaktiviertes, fötales Kälberserum (FCS) Durch Mykoplasmen und Viren gescreent | BioConcept Ltd. Amimed | 2-01F30-I | |
| HEPES-KOH, PH 7,4 | E& K Scientific Products | EK-654011 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Saccharose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Fibrinogen aus Rinderplasma | Calbiochem (Merck) | 341573-1GM | ACHTUNG: Gesundheitsschädlich durch Einatmen, bei Berührung mit der Haut und beim Verschlucken. Manipulieren Sie unter laminarer Strömung |
| Thrombin aus Rinderplasma | Sigma-Aldrich | T9549 | ACHTUNG: Gesundheitsgefahr, Handschuhe verwenden |
| PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH | Chi Scientific | maßgeschneidertes | |
| Vakuumfett | Sigma-Aldrich | 18405 | |
| 35 mm Schale, Nr. 1,5 Deckglas, 20 mm Glasdurchmesser, unbeschichtet | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Corning Falcon Easy-Grip Gewebekulturschalen | fisherscientific | 08-772A | |
| Steriler 500 mL Steritop-GP 33 mm Flaschenaufsatzfilter mit Gewinde, 0,22 μ m | Millipore | SCGPS05RE | |
| Polytetrafluorethylen (PTFE)-Folie | Dupont | 200A Teflon-FEP-Folie | |
| Millex-HV Spritzenfiltereinheit, 0,45 &Mikro; m, PVDF, 33 mm, gammasterilisiert | Millipore | SLHV033RS | |
| Millex-GV Spritzenfiltereinheit, 0,22 &Mikro; m, PVDF, 33 mm, gammasterilisiert | Millipore | SLGV033RS | |
| Drei-Well-Dissektionsschale aus Glas | Beliebig Unternehmen | ||
| Feine Pinzette, Größe 5, Dumont | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tandem-Scanner inverses konfokales Mikroskop TCS SP5, mit Resonanzscanner und HyD-Photomultiplier-Detektoren | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| Temperierkammer | Life Imaging Services | Der CUBE & BOX-Temperaturregelungssystem, kundenspezifischer | |
| Stage-Top-Feuchteregler | Life Imaging Services | kundenspezifischer | |
| Wasserimmersions-Mikrodispenser: Dispenser, erweiterte Mikropumpe MP6-Serie und Autoimmersion Objective Controller Software | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| SUM-Stack-Erstellung und 3D-Korrekturdrift-Plugin | ImageJ Software | ||
| 10x iterative Dekonvolution | AutoQuant und Imaris Software |
Referenzen
- Sheeba, V., Kaneko, M., Sharma, V. K., Holmes, T. C. The Drosophila circadian pacemaker circuit: Pas De Deux or Tarantella? Crit Rev Biochem Mol Biol. 43 (1), 37-61 (2008).
- Granados-Fuentes, D., Herzog, E. D. The clock shop: coupled circadian oscillators. Exp Neurol.
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Nachdrucke und Genehmigungen
