Method Article

Eine optimierte Evans blau Protokoll vaskulären Leck in der Maus bewerten

DOI:

10.3791/57037

⸱

September 12th, 2018

 ,  ,  , 
1Cardiovascular Pulmonary Research Laboratory, University of Colorado Denver, 2Division of Pulmonary Sciences and Critical Care Medicine, University of Colorado Denver, 3Denver VA Medical Center

In This Article

Summary

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In diesem Artikel ist eine kostengünstige, optimierte und einfache Protokoll beschrieben die verwendet die Evans-blauer Farbstoff-Methode zur Bewertung von Plasma Extravasation in den Organen der FVBN Mäuse, die für den Einsatz in anderen Sorten, Arten, und andere Organe oder Gewebe angepasst werden kann.

Abstract

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Vaskuläre Leck oder Plasma Paravasation, hat eine Reihe von Ursachen, und möglicherweise eine schwerwiegende Folge oder Symptom einer entzündlichen Reaktion. Diese Studie kann letztlich führen zu neue Erkenntnisse über die Ursachen des oder neue Wege zu hemmen oder Plasma Extravasation zu behandeln. Es ist wichtig, dass Forscher die richtigen Werkzeuge, einschließlich der besten Methoden zur Verfügung, für das Studium Plasma Extravasation. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll mit der Evans blauen Farbstoff Methode, für die Beurteilung der Plasma Extravasation in den Organen der FVBN Mäuse. Dieses Protokoll ist absichtlich einfach, so groß wie möglich, aber bietet hohe Datenqualität. Evans blauen Farbstoff wurde gewählt, vor allem weil es einfach für den durchschnittlichen Labor zu verwenden. Wir haben dieses Protokoll verwendet, Hinweise und Unterstützung für die Hypothese, dass das Enzym Neprilysin das Gefäßsystem gegen Plasma Extravasation schützen kann. Jedoch kann dieses Protokoll experimentell eingesetzt und leicht abgestimmt für den Einsatz in anderen Stämme von Mäusen oder in anderen Arten, in vielen verschiedenen Organen oder Geweben, für Studien, die anderen Faktoren verbunden, die wichtig zu verstehen sein können, zu verhindern oder zu behandeln sind Plasma Extravasation. Dieses Protokoll wurde umfassend optimiert und modifiziert von bestehenden Protokolle und vereint Zuverlässigkeit, Benutzerfreundlichkeit, Wirtschaft, und allgemeine Verfügbarkeit von Material und Ausrüstung, machen dieses Protokoll überlegen für die durchschnittliche Labor in verwenden Quantifizierung der Plasma Extravasation von Organen.

Introduction

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Vaskuläre Leck in den Organen bezieht sich auf Paravasation, oder Austritt von Blutplasma durch Lücken in dem Endothel der produziert nach Kapillare Venolen in den Organen. Dieses Plasma Extravasation oder erhöhten vaskulären Permeabilität, die an irgendeiner Art von einer entzündlichen Reaktion entstehen, kann schwerwiegende Folgen haben. So ist es wichtig, dass dieses Phänomen, seine Ursachen, Modulatoren und folgen, sind studiert und verstanden, und ebenso, dass Ermittler gute tools und Protokolle, um sie zu studieren. Die endothelialen Lücken können über eine Reihe von Reizen hergestellt werden, aber in der Regel entstehen durch die Einwirkung von Peptid Neurotran....

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Protocol

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Alle geltende internationalen, nationalen und/oder institutionellen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Tieren (Mäuse) folgten in den Experimenten in dieser Handschrift beschrieben.

Diese Methode verwendet FVBN Erwachsener Mäuse, im Alter von 16-20 Wochen, optimal für die Zwecke dieser Studie zu sein gefunden. Tag1 umfasst die Schritte 1-5 und Tag2 umfasst Schritte 6 und 7 (Abbildung 1).

1. Ausrüstung Vorbereitung

  1. Sichern Sie eine ausreichende Versorgung mit steril, Einweg-Spritzen und Nadeln, wenn Ketamin/Xylazin als die Betäubung verwendet wird (wie empfohlen). ....

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Results

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In Abbildung 1ist eine schematische Darstellung des Verfahrens gezeigt, die gefunden wurde, um die zuverlässige und konsistente Substanz P-induzierte Plasma Extravasation Werte von den Organen der FVBN Mäuse zur Folge haben. Dieser Vorgang dauert in der Regel zwei Tage Arbeit, getrennt durch mindestens 48 h der Wartezeit. Es ist möglich, noch mehr zu verbreiten, geschieht dies konsequent für alle Experimente zu vergleichen. Zum Beispiel nach die Organen am 1........

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Discussion

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Wie oben besprochen, kann das Studium der Plasma Extravasation letztlich neue Erkenntnisse über die Ursachen des oder führen neue Wege zu hemmen oder Plasma Extravasation zu behandeln. Der erfolgreiche Einsatz des Protokolls Plasma Extravasation (oben), wurde mit Evans blau färben, im aktuellen Manuskript nachgewiesen. Obwohl die gezeigten Daten wieder die Hypothese, dass NEP kann das Gefäßsystem schützen gegen Plasma Paravasation, dies ist ein sekundäres Ziel derzeit mit dem primären Ziel, um ein optimiertes Protokoll v.......

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren wollen Andy Poczobutt und Dr. Jori Leszczynski für ihre wertvolle Hilfe und Bearbeitungen dieses Manuskriptes danken.  Unterstützt durch Zuschüsse aus den nationalen Herz-, Lungen- und Blood Institute (NHLBI RO1 HL078929, PPG HL014985 und RO3 HL095439) und das Department of Veterans Affairs (Verdienst Review).

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
IsofluranVet One200-070Inhalationsanästhetikum
KetaminVet One200-055injizierbares Anästhetikum
XylazinLloyd Laboratories139-236injizierbare Anästhesiespritzen
(10,3 & 1 cc)Becton Dickinson309604, 309657, 309659
Nadeln (20G1,23G1 & 26G1/2)Becton Dickinson305178, 305193, 305111
Isofluran-InduktionskammerVetEquip941443
 VetEquipRC2Nagetier Circuit Controller 2
SauerstofftankAirgasUN 1072100% medizinisches
HeizkissenCWE Inc.TC-1000Temperaturregler
Rektal-TemperaturfühlerCWE Inc.10-09012Mauswaage
(für Nagetiere)OhausCS 2000
chirurgische Werkzeuge-SchereFine Science Werkzeuge15000-00Vannas Federschere 3mm gerade Klinge (Schneiden von Gefäßen)   
chirurgische Werkzeuge-PinzettenFine Science Werkzeuge11151-10Graefe extra feine Zange (Isolierung von Mausgefäßen)
chirurgische Werkzeuge-HämostatenFine Science Werkzeuge13009-12Halstead-Mücken-Hämostaten (stumpf zerlegen, Gewebe festhalten)
chirurgische Werkzeuge -NahttreiberFine Science Werkzeuge12502-12Olsen-Hegar Nahttreiber (Nähen)
chirurgische Instrumente-PinzetteFein Wissenschaftliche Werkzeuge11627-12Adson-Braune Krokodilzange (Gewebe, Greifen, Nähen, Ratten)
chirurgische Werkzeuge-ScherenFine Science Werkzeuge14110-15Mayo Schere mit hartem Schnitt 15 cm (Chirurgie, Dissektion, Knochen, Ratte)chirurgische Werkzeuge-Pinzetten
Fine Science Werkzeuge18025-10Nahtbindezange (für Millar-Katheter)
chirurgische Werkzeuge-ScherenFine Science Werkzeuge14078-10Lexer Babyschere gerade (Chirurgie, Maus)
chirurgische Werkzeuge-PinzettenFine Science Werkzeuge11254-20Dumont #5 Zange mit feiner Spitze (Rattengefäße, Dissektion)
chirurgische Werkzeuge-Schere FineScience Werkzeuge14082-09Dissektorschere 12 mm (Chirurgie, Rattenmaus)
chirurgische Werkzeuge-PinzetteFine Science Werkzeuge11051-10 10cm Graefe Zange (Gewebegreifen, Rattenmaus)
chirurgische Werkzeuge-ZangeFine Science Werkzeuge11251-35Dumont 5/45 Pinzette (Einführzange für Gefäße)
chirurgische Werkzeuge-RetraktorenFine Science Werkzeuge17012-11Weitlaner Retraktoren 2/3 Zähne (Ratte chirurgisch)
chirurgische Werkzeuge-ZangeFine Science Werkzeuge11294-00Dumont #4 Pinzette (Gefäßisolierung, Ratten, Mäuse)
chirurgische Werkzeuge-PinzetteFine Wissenschaftliche Werkzeuge11297-00Dumont #7 Pinzetten (Gewebegreifen, Sezieren)
chirurgische Werkzeuge-SchereFine Science Werkzeuge14058-11Schnitt-Irisschere (Mausdissektion, Knochen)
chirurgische Werkzeuge-PinzetteFine Science Werkzeuge11009-13gezackte, gebogene Semken-Zange (Gewebegreifen, Mausratte)
chirurgische Werkzeuge-HämostatenFine Science Werkzeuge13003-10Hartman gebogene Hämostaten (stumpf zerlegen, Gewebe halten)
chirurgische Werkzeuge-PinzettenFine Science Werkzeuge11006-12Adson-Zange mit Wellenschliff (Gewebegriff)
ClipperOsterA5
BandFisherbrand159015G
künstliche TränensalbeAkorn Inc13985-600-03
LidocainHospira0409-4277-012% injizierbare
Polyvinyl-KatheterTygonPV-1
Evans blueSigma AldrichE2129
Substanz PBachem H-1890
HeparinSagent Pharmaceuticals25201-400-101000 U/ml
KochsalzlösungHospira0409-7138-090,9% Natriumchlorid
PhenobarbitalVortech0298-9373-68
NatriumcitratFisher ScientificBP327-1
PBSSigma AldrichP4417-50TAB 
Kimwipes zum BlottenFisher Scientific06-666A
FormamidSigma Aldrich47670
MikrowaageDenver InstrumentAPX-60
MikrofugenröhrchenFisher Scientific07-200-534
Polystyrol 96 Well-PlatteBecton Dickenson351172
Absorptionsplatte LesegerätBioTekSynergy 2
Polyacrylamid-GeleBio-Rad3450014 
Protein-MolekulargewichtsstandardBio-Rad1610374
Protran-gestützte NitrocelluloseAmersham (GE)10600015
GelboxBio-Rad1658005
TrisFisher ScientificBP152-1
Tween20Sigma AldrichP-1379
NatriumchloridFisher WissenschaftlicherS271-1
primärer neop-polyklonaler AntikörperForschung & Technik D SystemsAF1182
Doxycyclin-ChowTeklad (HARLAN)TD.130750 
FVB/NJ Wildtyp-MäuseJackson001800
Sekundärantikörper (Ziegen-Anti-Kaninchen)ZyMed81-6120
ECL-Lösung-Western Lightening PlusPerkinElmerNEL104001EA
FilmPierce34091
1-Liter-Nasenkonus-Beatmungsschläuche harte

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Snijdelaar, D. G., Dirksen, R., Slappendel, R., Crul, B. J. Substance P. Eur J Pain. 4 (2), 121-135 (2000).
  2. Rubinstein, I., Iwamoto, I., Ueki, I. F., Borson, D. B., Nadel, J. A. Recombinant neutral endopeptidase attenuates substance P-induced plasma extravasation in the guinea pig s....

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