Zygotic 형광 복구 사진 표백 후 전체 기간 개발을 허용 하는 Chromatin 풀림에 대 한 분석
Summary
Chromatin 설사 blastomeres의 발달 잠재력에 관련 된 것 처럼 보인다. 그러나, 그것은 알 수 없습니다 여부 chromatin 설사 배아에 대 한 발달 잠재력에 대 한 신뢰할 수 있는 인덱스로 사용할 수 있습니다. 여기, chromatin 설사 평가 zygotes 만기를 개발할 수 있는 실험 시스템 설명 하고있다.
Abstract
라이브 영상 ontogenesis 동안 분자 이벤트의 분석을 허용 하는 강력한 도구입니다. 최근, chromatin 풀림 또는 개방 만능 배아 줄기 세포의 세포질 감 별 법 잠재력에 포함 될 표시 되었습니다. 그것은 이전에 비해 알려졌다 배아 줄기 세포와 zygotes 항구 그들의 totipotency와의 연결을 제안 하는 매우 느슨하게 chromatin 구조를. 그러나, 지금까지 그것은 되지 해결 되었습니다이 매우 느슨하게/오픈 chromatin 구조 배아 발달 잠재력에 대 한 중요 한 인지. 현재 연구에서이 가설을 시험 하는 실험 시스템 형광에 의해 분석 된 어떤 zygotes 사진 표백 후 복구 기간 어떤 뜻깊은 손상도 없이 개발할 수 있는 개발 되었다. 중요 한 것은,이 실험적인 시스템만 보온병 플레이트 히터 confocal 레이저 스캐닝 현미경 이외에 필요 합니다. 이 연구의 결과 분석 (FRAP) 분석 사진 표백 zygotic chromatin에서 분자 이벤트 전체 기간 개발에 대 한 중요 한 인지 조사를 사용할 수 있는 후 그 형광 복구를 좋습니다.
Introduction
수정, 후 염색 질 구조를 동적으로 변경 하 고 zygotic 염색 질 구조는 다음 결국 설립된1,2. 아버지 pronuclei에이 기간 동안 지배적인 chromatin 단백질 히스톤으로 protamine에서 변경 됩니다. 결과 chromatin sperms와 몇 가지 포인트 (예, 히스톤 변형 구성, 히스톤 수정) 여성 oocytes에서 매우 다르다. 따라서, 형성된 zygotic chromatin 이후의 배아 발달에 대 한 중요 한 것으로 생각 된다. 그러나, 오랜 기간 동안 zygotic chromatin 구조의 세부 정보를 공개 하는 노력에 불구 하 고 방법을 zygotes의 품질을 평가 하거나 1 셀 단계에서 그들의 전체-용어 개발의 염색 질 구조를 분석 하 여 예측 하는 적 설립.
이전 연구에서 그것은 발견을 zygotes 매우 느슨하게 chromatin 구조3. 현재, chromatin 풀림 또는 개방 세포 분화 배아 줄기 (ES) 세포4잠재력에 대 한 중요 한 요소가 될 여겨진다. ES 세포 자연, 동질성을 전시 하지 않습니다 하지만 오히려 다른 유형의; ES 세포 식민지, 일부 정도 높은 감 별 법 잠재력 blastomeres 2 셀 단계 배아의 비교를 획득. 상태 처럼 2 셀으로이 전환 중 ES에서 chromatin 설사 2 세포 단계 태아5와 비교에 변화 세포. 따라서, chromatin 설사 세포질 감 별 법 잠재력과 그것은 가능한 광범위 하 게 chromatin zygotes에서 열리는 중요 한 것 zygotic 개발 잠재력의 평가 위해 유용 하는 것 같다.
라이브 영상 때문에이 메서드는 후속 개발 및도 전체 용어 개발6수 있습니다 ontogenesis 동안 분자 이벤트의 분석을 허용 하는 강력한 도구입니다. 라이브 이미징 방법 중 하나로 FRAP 분석 preimplantation 배아와 ES 세포3,,45chromatin 설사 검사를 사용 되었습니다. Zygotic chromatin 설사 FRAP 분석 개발 전체-용어에 해로운 효과 없이 분석할 수 있습니다, 만약 1 셀 단계에서 배아의 품질 평가 대 한 유용한 도구 수 있습니다. 그러나,이 실험 방법으로 전체 용어 개발에 효과 있다 하지 조사 되었습니다. 최근, FRAP를 사용 하 여 zygotic chromatin 풀림을 평가 하는 실험 시스템 개발 되었다. 왜냐하면이 zygotes 위한 새로운 관측 시스템, 그것 zygotic FRAP (zFRAP) 되 나 했다. zFRAP 전체 용어 개발을 비판적으로 미치지 않았다 고 되었습니다 보고 다른 곳에서7. 이 보고서에서이 실험 방법의 프로토콜을 설명 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구에서 밝혀, zFRAP 분석 전체 용어 개발,이 방법은 분자 이벤트와 배아 발달 잠재력 사이 협회를 공개 하는 매우 유용한 도구 제안에 중요 한 손상을 발생 하지 않습니다. 그 세포의 차동 잠재력 된다 2 셀 단계 배아의 높은 ES 세포의 상태 처럼 2 셀으로 프로그래밍 하는 동안 chromatin 설사 변경으로 2 세포 단계 태아5와 비교 합니다. 따라서, zygotic chromatin 설사 배아 발달 잠재력…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리 감사 사토시 Kishigami, 사야카 와카야마, 히로 아키 Nagatomo, 사토시의 카 미 무라, 그리고가 나 Kishida 중요 한 의견 및 기술 지원 제공. 이 작품의 지;에 국립 대학 개혁을 승진 시키기를 위한 교육, 문화, 스포츠, 과학 및 기술 프로그램에 의해 부분적으로 투자 되었다 과학 (16 H 02593)의 승진, 아사 다 과학 재단과 T.W. 다케다 과학 재단에 대 한 일본 사회 Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다.
Materials
| Confocal laser scaning microscope | Olympus | FV1200 | FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7) |
| Thermo plate | Tokai Hit | TP-110RH26 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Micro manupilator | Narishige | MMO-202ND | |
| Pieze Micro Micromanipulator | Prime tech | PMAS-CT150 | |
| 35 mm culture dish | Falcom | 351008 | 35 x 100 mm style; for IVF |
| 60 mm culture dish | Falcom | 351007 | 60 x 15 mm style; for embryo culture |
| 50 mm culture dish | Falcom | 351006 | 50 x 9 mm style; for manipulation on the stage |
| 50 mm glass bottom dish | Matsunami | D910400 | 50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis |
| Mineral oil | Organic spceiality chemicals | 625071 | For FRAP analysis on the glass bottom dishes |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | For IVF and embryo culture |
| glass capillary | Drummond | 1-000-1000 | For handling mouse zygotes |
| Borosilicate glass | Prime tech | B100-75-10-PT | For microinjection of mRNA |
| Micropipett puller | Sutter instrument | P-97/IVF | For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm) |
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit | Thermo Fisher scientific |
AM1340 | |
| Poly (A) tailing kit | Thermo Fisher scientific |
AM1350 | |
| PVP solution 10% (PVP-HTF) | IrvineSceientific | 99311 | HEPES buffered HTF containing 10% PVP |
| Sodium HEPES | Sigma | H3784 | |
| pTOPO eGFP-H2B | Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6) | ||
| NorthernMax Gly Sample loading Dye | Thermo Fisher scientific |
AM8551 | For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA |
| Phenol chloroform isamyl alcohol | nacalai tesque | 25970-14 | |
| Chloroform | nacalai tesque | 08401-65 | |
| Not I | TOYOBO | NOT-111X | |
| Ethachinmate | WAKO | 318-01793 | |
| 3664 Otical power meter | Hioki | 3664 | Power meter for laser power |
| Stereomicmicroscope | Olympus | SZX16 |
Referenzen
- Burton, A., Torres-Padilla, M. E. Epigenetic reprogramming and development: a unique heterochromatin organization in the preimplantation mouse embryo. Brief Funct Genomics. 9, 444-454 (2010).
- Okada, Y., Yamaguchi, K. Epigenetic modifications and reprogramming in paternal pronucleus: sperm, preimplantation embryo, and beyond. Cell Mol Life Sci. 74, 1957-1967 (2017).
- Ooga, M., Fulka, H., Hashimoto, S., Suzuki, M. G., Aoki, F. Analysis of chromatin structure in mouse preimplantation embryos by fluorescent recovery after photobleaching. Epigenetics. 11, 85-94 (2016).
- Meshorer, E., et al. Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells. Dev Cell. 10, 105-116 (2006).
- Boskovic, A., et al. Higher chromatin mobility supports totipotency and precedes pluripotency in vivo. Genes Dev. 28, 1042-1047 (2014).
- Yamagata, K., Ueda, J. Long-term live-cell imaging of mammalian preimplantation development and derivation process of pluripotent stem cells from the embryos. Dev Growth Differ. 55, 378-389 (2013).
- Ooga, M., Wakayama, T. FRAP analysis of chromatin looseness in mouse zygotes that allows full-term development. PLoS One. 12, e0178255 (2017).
- Quinn, P., Begley, A. Effect of human seminal plasma and mouse accessory gland extracts on mouse fertilization in vitro. Australian journal of biological sciences. 37, 147-152 (1984).
- Chatot, C. L., Lewis, J. L., Torres, I., Ziomek, C. A. Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium. Biology of reproduction. 42, 432-440 (1990).
- Bae, J., Sung, B. H., Cho, I. H., Song, W. K. F-actin-dependent regulation of NESH dynamics in rat hippocampal neurons. PLoS One. 7, e34514 (2012).
- Dieteren, C. E., et al. Defective mitochondrial translation differently affects the live cell dynamics of complex I subunits. Biochim Biophys Acta. 1807, 1624-1633 (2011).
- Subramanian, V., et al. H2A.Z acidic patch couples chromatin dynamics to regulation of gene expression programs during ESC differentiation. PLoS Genet. 9, e1003725 (2013).
- Hayashi-Takanaka, Y., et al. Tracking epigenetic histone modifications in single cells using Fab-based live endogenous modification labeling. Nucleic Acids Res. 39, 6475-6488 (2011).
- Yamazaki, T., Yamagata, K., Baba, T. Time-lapse and retrospective analysis of DNA methylation in mouse preimplantation embryos by live cell imaging. Dev Biol. 304, 409-419 (2007).
- Puschendorf, M., et al. PRC1 and Suv39h specify parental asymmetry at constitutive heterochromatin in early mouse embryos. Nat Genet. 40, 411-420 (2008).
