Dit artikel beschrijft een methode voor het analyseren van immuun celinhoud van adipeus weefsel door isolatie van immuuncellen uit vetweefsel en latere analyse met behulp van stroom cytometry.
Infiltratie van immuuncellen in de subcutane en viscerale adipeus weefsel (AT) deposito’s leidt tot een low-grade ontsteking bij te dragen tot de ontwikkeling van obesitas-geassocieerde complicaties, zoals diabetes type 2. Kwantitatief en kwalitatief onderzoek doen naar de immuun cel subsets in mens op deposito’s, hebben wij een stroom cytometry aanpak ontwikkeld. De stromale vasculaire noemer (SVF), met de immuun cellen, is geïsoleerd van subcutane en viscerale op biopsieën door collagenase spijsvertering. Adipocytes worden verwijderd na het centrifugeren. De cellen van SVF zijn gekleurd voor meerdere membraan-gebonden markeringen geselecteerd om te differentiëren tussen immuun cel subsets en geanalyseerd met behulp van stroom cytometry. Als gevolg van deze aanpak, pro – en anti – inflammatory macrofaag deelverzamelingen, dendritische cellen (DC’s), B-cellen, CD4+ en CD8+ T-cellen en NK-cellen kunnen worden gedetecteerd en kan worden gekwantificeerd. Deze methode geeft gedetailleerde informatie over immuuncellen in AT en het bedrag van elke specifieke deelverzameling. Aangezien er talrijke fluorescerende antilichamen beschikbaar, kan onze stroom cytometry aanpak worden aangepast voor het meten van verschillende andere cellulaire en intracellulaire markeringen van belang.
Obesitas wordt gekenmerkt met low-grade AT ontsteking1 en infiltratie van pro-inflammatoire immuuncellen in zowel viscerale en onderhuidse op (BTW, zat). Accumulatie van pro-inflammatoire immuuncellen in de BTW leidt tot insulineresistentie die een primaire risicofactor is voor het ontwikkelen van type 2 diabetes2. Immune cellen van het aangeboren en adaptieve immuunsysteem zijn te vinden in de zwaarlijvige AT, zoals macrofagen, mestcellen, neutrofielen, CD4+ en CD8+ T-cellen en B-cellen3,4,5,6 ,7. Deze immuuncellen, samen met de endotheliale cellen, stromale cellen adipocyte progenitorcellen, fibroblasten en pericytes, vormen de SVF8 en zijn de belangrijkste bron van pro-inflammatoire stoffen in de AT-9.
De inflammatoire status van AT wordt vaak onderzocht door technieken en westelijke vlek10, qPCR11, immunohistochemistry11. Echter bij het gebruik van deze technieken, de gehele AT adipocytes en SVF, wordt gebruikt. Dit maakt het moeilijk om te bepalen van het bedrag en de deelverzamelingen van immune cellen aanwezig in de AT. Immune cellen hebben verschillende cel markeringen te definiëren en te categoriseren, zoals macrofagen. Macrofagen weergeven significante heterogeniteit in zowel de functie als de cel oppervlakte marker expressie12. Daarom zijn ze vaak onderverdeeld in twee macrofaag populaties: M1 en M2. M2 macrofagen worden meestal genoemd als alternatief geactiveerde macrofagen12,13 en wonen in het AT van mager, metabolisch normale mensen14. Echter, tijdens obesitas, een fenotypische switch komt uit M2 macrofagen M1 macrofagen. Deze klassiek M1 macrofagen express CD11C12 en accumuleren rond dood adipocytes om te vormen van de kroon-achtige structuren13geactiveerd. Het is aangetoond dat CD11C+ macrofagen in de AT aantasten insuline actie en zijn geassocieerd met insulineresistentie in zwaarlijvige mensen15. Als u wilt identificeren M1 en M2 macrofagen in de AT, is immunohistochemistry een optie. Deze techniek geeft informatie over de locatie van de macrofagen in de weefsels. Echter zal het beperken van het aantal markeringen die kan worden gebruikt in een kleuring. Bovendien, het is ook moeilijk te kwantificeren. Daarom, om te onderzoeken de verschillende immuun cel subsets in de BTW- en zat deposito’s, hebben wij een stroom cytometry aanpak ontwikkeld. Deze aanpak geeft ons de mogelijkheid om meerdere markers per cel met één stroom cytometry analyse gebruiken voor het definiëren van cel subsets en tellen van het aantal elke deelverzameling aanwezig in de AT-deposito’s.
Deze methoden wordt beschreven hoe om te isoleren van de FØROYA van BTW en zat en kwantificeren van de relatieve hoeveelheden van immune cellen binnen deze weefsels. Bovendien staat de methoden het bepalen van de expressie van merkers op specifieke celtypes.
Stroom cytometry van weefsel immune cellen is een krachtige techniek om fenotype de immunologische toestand van weefsels. De kwantificering van weefsel immune cellen hebben vele toepassingen. Zoals beschreven in de resultaten, is het mogelijk om te vergelijken van de aanwezigheid van bepaalde immuuncellen tussen groepen van patiënten (b.v.mager vs. zwaarlijvige). Daarnaast door te voeren ook stroom cytometry op bloed van de dezelfde patiënten, kunnen associaties tussen circulerende cellen en weefselcellen worden onderzocht. Met deze toepassing konden wij vaststellen dat een specifieke subset van circulerende monocyten gekoppeld van pro-inflammatoire CD11C is+ adipeus weefsel macrofagen16.
Aanpassingen van het protocol beschreven zal haar toepassingen uitbreiden naarmate talrijke beschikbare fluorescerende antilichamen stroom cytometry zeer veelzijdig maken. Met verschillende antilichamen bijna alle celtypes kunnen worden onderscheiden en de uitdrukking van veel markers kan worden gedetecteerd. Daarnaast is het mogelijk om markeringen intracellulair vlek door het permeabilizing van de celmembraan zodat de intracellulaire binding van de fluorescerende antilichamen. Deze kenmerken kunnen onderscheid van de zeer uiteenlopende macrofaag bevolking buiten de overdreven vereenvoudigde M1 en M2 macrofaag subtypen. Naast meting van oppervlakte marker expressie, kunnen eiwitten (d.w.z., cytokines) worden gekleurd intracellulair voorlichting over macrofaag functionaliteit. Daarnaast worden proliferatie markeringen zoals Ki67 gebruikt voor het kwantificeren van proliferatie tarieven. Zoals beschreven, was onderscheid tussen macrofagen en DCs gebaseerd op MFI niveaus van DC markers. Een algemene macrofaag-marker, zoals CD68 kan worden opgenomen in de macrofaag deelvenster (FACS deelvenster 1). CD68 moet echter worden gekleurd intracellulair vereisen permeabilization van de celmembraan die niet beter en zou verlenging van het protocol. Andere macrofaag markers zijn deelverzameling markeringen zoals CD163 en CD206 of CD11c, de laatste wordt geïntegreerd in het deelvenster van de macrofaag hier gepresenteerd.
In onze FACS panelen, een marker te onderscheiden van levende en dode cellen werd niet opgenomen, die zou wenselijk zijn omdat hierdoor een nauwkeuriger uitsluiting van dode cellen dan het gebruik van FSC en WS. Vaak gebruikt zijn de DNA kleuring levensvatbaarheid kleurstoffen propidium jodide (PI) of 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), evenals gratis amine reageren kleurstoffen zoals de LIVE/DEAD Fixable dode cel Stain Kit, die beschikbaar is in verschillende kleurstof kleuren. Nochtans, PI en DAPI niet worden gebruikt bij de vaststelling van de cellen. Zoals beschreven in het protocol, kan de kleuring van de levensvatbaarheid van de LIVE/DEAD Fixable Red Dead cel worden geïntegreerd in beide panelen zonder de algehele FACS gating strategie.
Bovendien, worden de gegevens uitgedrukt als een percentage van levende cellen wat betekent dat alle gegevens zijn relatief. Alleen door het invoeren van een exacte, zou bekend aantal cellen in de stroom cytometer, het mogelijk om te bepalen van het exacte aantal elk celtype. Een geschatte aantal cellen kon worden berekend na het tellen van de cellen in de Fractie SVF met behulp van een tellen kamer. Dit aantal zou moeten worden aangepast voor de hoeveelheid biopsie weefsel gebruikt om te isoleren van de FØROYA, maar dit heeft beperkingen bij het vergelijken van mager tot zwaarlijvige op. Een soortgelijke massa van zwaarlijvige AT bestaat uit minder adipocytes zoals ze zijn gevuld met lipiden en aanzienlijk hebben uitgebreid. Dit kan leiden tot een onderschatting van immuun celaantal als aantal immuuncellen per gram op of per adipocyte.
In menselijke studies, wordt opneming van patiënten meestal gedaan over een langere periode van tijd, waardoor standaardisatie van experimentele procedures van groot belang. Voor vergelijking van stroom cytometry gegevens tussen patiënten zijn er verschillende opties. Zoals beschreven in dit protocol, kunnen cellen vóór de meting waardoor analyse van verschillende monsters op dezelfde dag worden vastgesteld. Dit kan ook worden bereikt door bevriezing van de FØROYA voordat kleuring hen, waardoor de kleuring procedure gelijk is tussen alle monsters, maar de levensvatbaarheid van de cellen kan worden beïnvloed. Tot slot, ook werkzaam in deze studie, zijn fluorescerende kralen installeren compensatie niveaus en cytometer bijhouden kralen bi-wekelijkse werden gebruikt voor het standaardiseren van dagelijkse metingen van de cytometer. Deze laatste optie is het meest efficiënt wanneer het meten van monsters uit een studie die verspreid over een lange periode van tijd.
Een beperkende factor voor stroom cytometry is in het algemeen het gebruik van fluorescentie. Het aantal fluorescerende etiketten die gelijktijdig kunnen worden ontdekt is beperkt als gevolg van overlapping in emissie spectra. Echter met slimme FACS deelvenster ontwikkeling en het gebruik van verschillende antilichaam cocktails per BTW- of zat monster, kan dit probleem worden opgelost zoals beschreven in dit protocol. Een belangrijk aspect van FACS deelvenster ontwikkeling is FMO besturingselementen. Met behulp van alle antilichamen van het deelvenster met uitzondering van één, kunnen de potentiële autofluorescence niveaus worden gewaardeerd bij het vergelijken van de FMO met het volledige deelvenster. Hierdoor is nauwkeurige gating van populaties en deze procedures moeten worden uitgevoerd bij het opzetten van een nieuw FACS paneel. Bovendien kunnen nieuwe generaties van FACS apparaten detecteren maximaal 50 parameters waardoor gelijktijdige detectie van vele kenmerken per cel. Een andere kwestie met betrekking tot het aspect van de fluorescentie is de autofluorescence van cellen, met name in macrofagen. Na excitatie van de cellen met de laser FACS (voornamelijk met 488 nm golflengte excitatie), deze cellen een fluorescent signaal uitstoten (voornamelijk < 640 nm) dat kan overlapping met de spectra van de emissie van het antilichaam labels17,18. Om dit te verklaren, moeten onbevlekt cellen worden gemeten om te bepalen van de autofluorescence in elk kanaal. Met deze kennis, moeten fluorochromes worden geselecteerd die een signaalsterkte die hoger is dan het signaal van de autofluorescent worden weergegeven. Dit autofluorescent achtergrond signaal moet rekening worden gehouden bij het bepalen van de gating strategie van de bevolking. Dus, door toepassing van dit protocol en de intelligente FACS deelvenster ontwerp kan in diepte fenotype macrofaag subtypen. Nieuwe verschillende AT macrofagen en hun functie kunnen worden gekarakteriseerd.
The authors have nothing to disclose.
We bedank J. van de Gaar en M. Vroomen (Universiteit Maastricht, Nederland) voor hun technische ondersteuning. Bovendien, we bedank K. Verboven, D. Hansen, J. Jocken, en E. Blaak voor het verstrekken van het bloed en weefsel biopsieën gebruikt voor het opzetten van dit protocol en de latere experimenten.
Centrifuge | Hettich Rotanta 460R | 5660 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)-Ham’s F12 | Gibco ThermoFisher | 31330-095 | |
Collagenase XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657-1g | |
Collagenase I from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C0130-1g | |
DNAse I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
NH4Cl | Merck | 1.01145.0500 | |
Bovine Serum Albumine | Sigma Aldrich | A4503-100 | |
NaN3 | Merck | 1.06688.0100 | |
200 µM syringe Filcons | BD Biosciences | 340613 | |
70 µM filter | Greiner Bio-one | 542070 | |
Fc block / human IgG | Sigma Aldrich | 14506 | |
Formaldehyde | Merck | 1.04003.2500 | |
CD11b-BV421 | Biolegend | 301324 | |
CD19-Fitc | BD Biosciences | 555412 | |
CD3-Fitc | BD Biosciences | 561807 | |
CD66b-Fitc | BD Biosciences | 555724 | |
CD56-Fitc | BD Biosciences | 562794 | |
CD11c-APC-Cy7 | Biolegend | 337218 | |
CD45-PE-Cy7 | BD Biosciences | 557748 | |
CD19-BV421 | Biolegend | 302234 | |
CD3-V500 | BD Biosciences | 561416 | |
CD56-APC | Biolegend | 318310 | |
CD4-PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 300528 | |
CD8-APC-H7 | BD Biosciences | 641400 | |
CD303-PE | Biolegend | 354204 | |
CD141-APC | Biolegend | 344106 | |
FACS-Canto II | BD Biosciences | ||
96 v-shape well plate | Greiner Bio-one | 651101 | |
PBS PH 7.4 | Gibco ThermoFisher | 10010023 | |
FACS tube 5 mL polystyrene round-bottom tube | Corning | 352052 | |
IgG from human serum | Sigma Aldrich | I4506 | |
Anti-Rat Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD Biosciences | 552844 | |
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD Biosciences | 552843 | |
LIVE/DEAD Fixable Red Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L23102 | |
IKA MS 3 basic shaker | Sigma Aldrich | Z645028-1EA |