Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll, um die antimikrobielle Wirkung von 5-Aminolevulinic Säure-vermittelten die photodynamische Therapie (ALA-PDT) auf Staphylococcus Aureus Biofilm untersuchen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um ein in-Vitro Modell zur Untersuchung der Behandlung von bakteriellen Biofilmen mit PDT in der Zukunft zu entwickeln.
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Methodenartikel
Eine In vitro- Modell, die Wirkung von 5-Aminolävulinsäure-vermittelten photodynamische Therapie auf Staphylococcus Aureus Biofilm zu studieren
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Staphylococcus aureus (S. Aureus) ist eine gemeinsame menschliche Erreger, wodurch pyogener und systemische Infektionen. S. Aureus Infektionen sind schwer, nicht nur durch die Entstehung von Antibiotika-resistenten Stämme, sondern auch seine Fähigkeit, Form Biofilme zu beseitigen. Vor kurzem hat die photodynamische Therapie (PDT) als eines der möglichen Behandlungen zur Steuerung von Biofilm-Infektionen angegeben wurde. Allerdings sind weitere Studien erforderlich, um unser Wissen über ihre Wirkung auf bakterielle Biofilme sowie die zugrunde liegenden Mechanismen zu verbessern. Dieses Manuskript beschreibt eine in Vitro -Modell der PDT mit 5-Aminolävulinsäure (5-ALA), ein Vorläufer der eigentlichen Photosensitizer Protoporphyrin IX (PpIX). Kurz, Reifen S. Aureus Biofilme mit ALA inkubiert und dann Licht ausgesetzt waren. Anschließend war die antibakterielle Wirkung der ALA-PDT auf S. Aureus Biofilm durch Berechnung der koloniebildenden Einheiten (KBE) quantifiziert und visualisiert durch Lebensfähigkeit fluoreszierende Färbung durch konfokale Laser-scanning-Mikroskopie (CLSM). Repräsentative Ergebnisse zeigten eine starke antibakterielle Wirkung der ALA-PDT auf S. Aureus Biofilmen. Dieses Protokoll ist einfach und kann zur Entwicklung eines in-vitro- Modells um die Behandlung von S. Aureus Biofilme mit ALA-PDT zu studieren. In Zukunft könnte es auch in PDT Studien unter Verwendung anderer Photosensibilisatoren für verschiedene Bakterienstämme mit minimalen Anpassungen verwiesen werden.
Einleitung
S. Aureus ist eine wichtige grampositive Erreger, die der Haut und der Schleimhaut des menschlichen Wirte kolonisiert. Seine Fähigkeit, Form Biofilme gilt als einen wichtigen Aspekt ihrer Pathogenese-1. Bakterielle Biofilme sind eine Gemeinschaft von Bakterien, die eingebettet in eine selbst erstellte Matrix, extrazelluläre Polymere Substanzen, einschließlich Polysaccharid, DNA und Proteinen besteht. Diese Matrix spielt eine bedeutende Rolle in der Persistenz von bakteriellen Infektionen, einen Beitrag zu einem hohen Grad des Widerstands gegen das menschliche Immunsystem und aktuellen antimikrobiellen Therapien2....
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Protokoll
1. die Biofilmbildung
-
Biofilmbildung in 96-Well-Mikroplatten
- Abrufen der S. Aureus -Stamm USA300 und 3 Biofilm bilden klinische Stämme (C1 - C3) bei-80 ° c gelagert
Hinweis: Die Fähigkeit der klinische Stämme zu bilden Biofilme durch die Mikrotiter-Platte-Assay bestimmt war zuvor beschriebenen15. - Das Bakterium in 5 mL Tryptone-Soja-Bouillon (TSB)-Medium zu impfen, und pflegen in einem Inkubator mit schütteln bei 37 ° C über Nacht an der stationären Phase.
- Zentrifugieren Sie die Übernachtung Bakterienkultur bei 4.000 x g für 10 min bei 25 ° C und verwerfen Sie den überstand.....
- Abrufen der S. Aureus -Stamm USA300 und 3 Biofilm bilden klinische Stämme (C1 - C3) bei-80 ° c gelagert
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Ergebnisse
Die Lebensfähigkeit der Bakterien in den Biofilmen war zurückgegangen, nachdem ALA-PDT-Behandlung im Vergleich zu den Kontrollen (ALA - LED, ALA + LED- und ALA-LED +) in USA300 und die drei klinische Stämme (Abbildung 1).
Zur Bestätigung der Ergebnisse von der KBE assay und beobachten die antibakterielle Wirkung von ALA-PDT auf der S. Aureus Biofilm in Situ, die USA300 Biofilmen wu.......
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Diskussion
PDT wurde eine gut untersuchte Therapie für die Behandlung von Krebs, da es mehr als 100 Jahren erfunden wurde18. Im letzten Jahrzehnt PDT als antimikrobielle Strategie angewendet wurde und Wirksamkeit gegen einige Antibiotika-resistente Pathogene Bakterien12gezeigt hat. Im Vergleich zu den planktonischen Zustand, scheinen bakterielle Biofilme resistent gegen Antibiotika-Behandlung3, zu sein, während die Wirkung von ALA-PDT auf Biofilme noch nicht vo.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von National Nature Science Foundation of China für junge Wissenschaftler (Nr. 81300810), Shanghai junge Arzt Trainingsprogramm (Nr. 20141057) und National Natural Science Foundation of China (81671982, 81271791 und 81571955) finanziert. Wir möchten LetPub (www.letpub.com) Danke für die sprachliche Unterstützung bei der Vorbereitung dieser Handschrift.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Trypton-Soja-Bouillon (TSB) | OXOID | CM0129B | |
| Trypton-Soja-Agar (TSA) | OXOID | CM0131 | |
| SYTO9 | Thermo Fisher Scientific | L7012 | Die LIVE/DEAD BacLight Kits für die bakterielle Lebensfähigkeit |
| Propidiumiodid (PI) | Thermo Fisher Scientific | L7012 | Die LIVE/DEAD BacLight Kits für die bakterielle Lebensfähigkeit |
| Pankreatin | Sigma-Aldrich | P3292 | |
| 5-Aminolävulinsäure (ALA) | Fudan Zhangjiang Bio-Pharm | 3.1 | |
| Staphylococcus aureus Stamm USA300 | / | Die Quelle von USA 300 Referenzen " Tenover FC, Göring RV. J Antimikrobielle Chemother. September 2009; 64(3):441-6". | |
| Staphylococcus aureus klinische Stämme (C1-C3) | / | / | Alle klinischen Stämme wurden von Patienten mit chronischer Rhinosinusitis in der Abteilung für Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde-Kopf- und Halschirurgie, Augen- und HNO-Krankenhaus der Fudan-Universität isoliert [Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, et al. PLoS One. 2017 Mar; 12(3): e0174627]. |
| 96-Well-Mikrotiterplatten | Corning Inc | 3599 | Durchsichtige Mikrotiterplatten aus Polystyrol mit flachem Boden, TC-behandelt, einzeln verpackt, mit Deckel, sterile |
| Fluorodish | NEST Biotechnologie | 801001 | Glasboden, pyrogene |
| Eppendorf Safe-Lock-Röhrchen, 1,5 mL | Eppendorf | ||
| Eppendorf Mikrozentrifuge 5417 | Eppendorf | Z365998 | SIGMA | |
| Inkubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE4000 | MaxQ 4000 Tisch-Orbitalschüttler |
| Leuchtdiode (LED) | Wuhan Yage Optische und elektronische Technik CO | LED-IB | |
| Leica TCS SP8 konfokales Laser-Scanning-Mikroskop | Leica Microsystems | ||
| Leica LAS AF Software | Leica Microsystems | ||
| IMARIS Software | Bitplane |
Referenzen
- Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother. 45 (4), 999-1007 (2001).
- Rabin, N., et al. Biofilm formation mechanisms and targets for developing antibiofilm agents. Future Med Chem. 7 (4), 493-512 (2015).
- Mah, T. F., O'Toole, G. A.
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Nachdrucke und Genehmigungen
