Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Unterscheidung von menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs) in Bauchspeicheldrüse/Zwölffingerdarm Homeobox Protein 1+ (PDX1+) Zellen für die Erzeugung von Pankreas Linien auf Basis des-Kolonie Typ Monolage Wachstums der einzelne Zellen zu trennen. Diese Methode ist geeignet für die Herstellung von homogenen hPSC-abgeleitete Zellen, Genmanipulation und Überprüfung.
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Methodenartikel
Effiziente Generation der Bauchspeicheldrüse/Zwölffingerdarm Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Bauchspeicheldrüsen-Vorfahren aus hPSCs in Haftung Kulturen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSC)-abgeleitete Zellen der Bauchspeicheldrüse sind eine vielversprechende Zelle Quelle für regenerative Medizin und als Plattform für menschliche Entwicklungsprozesse zu studieren. Stufenweise gerichtet, Differenzierung, die Entwicklungsprozesse rekapituliert ist einer der wichtigsten Wege, einschließlich Bauchspeicheldrüse/Zwölffingerdarm Homeobox Protein 1+ Zellen der Bauchspeicheldrüse zu generieren (PDX1+) Pankreas Vorläuferzellen. Konventionelle Protokolle initiieren die Differenzierung mit kleinen Kolonien kurz nach dem Durchgang. Jedoch in den Zustand der Kolonien oder Aggregate, Zellen sind anfällig für Heterogenitäten, die die Differenzierung zu PDX1 behindern könnte+ Zellen. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Unterscheidung von hPSCs in PDX1+ Zellen. Das Protokoll besteht aus vier Schritten und initiiert die Differenzierung nach Aussaat dissoziierten Einzelzellen. Die Induktion von SOX17+ endgültige Entoderm Zellen folgte der Ausdruck der beiden primitiven Darm Rohr Marker, HNF1β und HNF4α und eventuelle Differenzierung in PDX1+ Zellen. Dieses Protokoll bietet einfache Handhabung zu verbessern und stabilisieren die Differenzierung Effizienz einiger hPSC Zeilen, die bisher gefunden wurden, um ineffizient in endodermische Linien oder PDX1 zu unterscheiden+ Zellen.
Einleitung
Die Bauchspeicheldrüse besteht hauptsächlich aus exokrinen und endokrinen Zellen, und seine Dysfunktion oder Überlastung verursacht mehrere Krankheiten wie Pankreatitis, Diabetes und Bauchspeicheldrüsenkrebs. Um die Pathogeny des Pancreatopathy zu erhellen, ist es notwendig, den Entwicklungsprozess und die Funktion von Zellen der Bauchspeicheldrüse zu analysieren. Darüber hinaus ist eine stabile Zelle Versorgung mit robuste Qualität herstellen Zellgewebe/Supplementierung Therapie erforderlich. Menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSC)-abgeleitete Zellen der Bauchspeicheldrüse sind eine vielversprechende Zelle Quelle für diese Zwecke, und die Differenzierung Protok....
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Protokoll
Experimente mit hPSCs wurden von der Ethikkommission der Abteilung für Medizin und Graduate School of Medicine, Universität Kyoto genehmigt.
1. Vorbereitung der Materialien
Hinweis: Bereiten Sie alle Medien und Reagenzien für die Zellkultur in einer sterilen Umgebung. Wärmen Sie base Nährmedien auf Raumtemperatur (RT) vor dem Gebrauch. Medium für Differenzierung innerhalb 6 h bei RT. Details der Reagenzien verwendet wird finden Sie in Tabelle der Materialien.
-
Differenzierung (Abbildung 1A)
- Stufe ....
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Ergebnisse
Verbreitende HiPSCs (585A129,30) verdichten sich und bilden eine homogene Monolayer (Abbildung 1 b), die zur Differenzierung geeignet ist. Undifferenzierte HiPSCs (Stufe 0) sind getrennt und neu ausgesät als Einzelzellen bei niedrigen Zelldichten (1-1,5 x 105 Zellen/cm2). Innerhalb von 1 h die Zellen sind an der Platte befestigt und zu Vorsprung zu zeigen beginnen. Am 1. Tag werden die Zellen stark vermehrt und .......
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Diskussion
Die Generation der PDX1+ Zellen besteht aus mehreren Schritten; Daher ist es wichtig, Zellen zu gegebener Zeit zu behandeln. Unter den Schritten der Induktion Effizienz der endgültigen Entoderm wirkt sich weitgehend auf die endgültige Induktion Effizienz, möglicherweise durch Interferenzen von anderen kontaminierenden Abstammung-Zellen (d. h. Mesoderm und Ektoderm), die vermehren sich und/oder absondern können Faktoren, die die spezifische Differenzierung zu stören. Wenn der Anteil der SOX17+ Zellen.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde zum Teil unterstützt durch die Finanzierung der Japan Society für die Förderung von Science (JSPS) durch Scientific Research (C) (JSPS KAKENHI Grant Number15K09385 und 18 K 08510) t.t. und Beihilfe für JSPS Research Fellows (JSPS KAKENHI Grant-Nummer 17J07622), a.k., und die Japan-Agentur für medizinische Forschung und Entwicklung (AMED) durch seine Forschung gewähren "Core Center für iPS Zellforschung, Research Center-Netzwerk für die Realisierung der regenerativen Medizin" K.O. Die Autoren danken Dr. Peter Karagiannis für das Manuskript zu lesen.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 3-Keto-N-aminoethyl-N′-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamin | Toronto Research Chemicals | K171000 | CYC |
| 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoe | Santa Cruz Biotechnology | SC-203303 | TTNPB |
| 50 mL Konische sterile Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Anti-CDX2 Antikörper [EPR2764Y] | Abcam | Ab76541 | Anti-CDX2, &mal 1/1000 Verdünnung |
| B-27 Ergänzung (50 &mal;) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | Serumfreies Nahrungsergänzungsmittel |
| BD FACSAria II Zellsortierer | BD Biosciences | Für die Durchflusszytometrie | |
| Biomedizinischer Gefrierschrank | SANYO | MDF-U538 | Für -30 ° C Lagerung |
| Objektträger für die Zellzählung für TC10/TC20 Zellzähler, Zweikammer | BIO-RAD | 1450011 | Zählobjektträger |
| Glas ZELLKULTUR MULTIWELL-PLATTE, 6 WELL, PS, KLAR | Greiner bio-one | 657165 | Für Differenzierungskulturen/6-Well-Platte |
| Zentrifuge | TOMY | AX-310 | Für die Zellkultivierung |
| Zentrifuge | TOMY | MX-305 | Für RT-qPCR |
| CHIR99021 | Axon Medchem | Axon 1386 | |
| CLEAN BENCH | SHOWA KAGAKU | S-1601PRV | Clean |
| bench Corning CellBIND 6-Well-Platte | Corning | 3335 | Für die feederfreie Kultur von hPSCs/6-Well-Platte |
| Corning Matrigel Basalmembran-Matrix-Wachstumsfaktor reduziert | Corning | 354230 | Basalmembran-Matrix |
| Corning Synthemax II-SC Substrat | Corning | 3535 | Für die feederfreie Kultur von hPSCs/synthetischem Oberflächenmaterial für hPSCs |
| Kryostat | Leica | Leica CM1510 S | Zur Immunfärbung von Aggregaten. |
| Cytofix/Cytoperm Kit | Becton Dickinson | 554714 | Perm/Wash Puffer ist Permeabilisierung/Waschpuffer. Cytofix/Cytoperm-Puffer ist ein Fixierungs- und Permeabilisierungspuffer. |
| Dako Pen | Dako | S2002 | Für die Immunfärbung von Aggregaten |
| dNTP-Mix (10 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18427-088 | Für RT-qPCR |
| Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Sekundärantikörper, × 1/500 Verdünnung |
| Esel Anti-Maus IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10036 | Sekundärantikörper, × 1/500 Verdünnung |
| Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10040 | Sekundärantikörper, × 1/500 Verdünnung |
| Esel Serum | Merck Millipore | S30 | Esel Serum |
| D-PBS(-) ohne Ca oder Mg | Nacalai tesque | 14249-95 | DPBS |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Für die Feeder-freie Kultivierung von hPSCs/hPSC-Erhaltungsmedium |
| Falcon 5 mL Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden, mit Zellsieb Schnappkappe | Corning | 352235 | 5 mL Polystyrolröhrchen mit rundem Boden und Zellsieb |
| Filterspitze, 1.000 & micro; L | Watoson | 124-1000S | Verwendung zusammen mit Pipetten |
| Filterspitze, 20 & Mikro; L | Watoson | 124-P20S | Verwendung zusammen mit Pipetten |
| Filterspitze, 200 & Mikro; L | Watoson | 124-P200S | Verwendung zusammen mit Pipetten |
| Fluoreszenzmikroskop | Keyence | BZ-X700 | Für die Immunfärbung |
| Forma Steri-Cycle CO2 Inkubator | Thermo Fisher Scientific | 370A | Inkubator |
| HNF-1β Antikörper (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7411 | Anti-HNF1β, × 1/200 Verdünnung |
| HNF-4α Antikörper (H-171) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8987 | Anti-HNF4α, &mal 1/200 Verdünnung |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | Für die Zellkernfärbung, &mal 1/200 Verdünnung |
| Menschliche Bauchspeicheldrüse Gesamt-RNA | Ambion AM7954 | Für RT-qPCR | |
| Humane PDX-1/IPF1 Antikörper | R& D Systems | AF2419 | Anti-PDX1, Ziegen-IgG, × 1/200 Verdünnung |
| Humane SOX17 Antikörper | R& D Systems | AF1924 | Anti-SOX17, × 1/200 Verdünnung |
| Verbessertes MEM Zink Option Medium | Thermo Fisher Scientific | 10373-017 | iMEM |
| Inkubationskammer | Cosmo Bio | 10DO | Für die Immunfärbung von Aggregaten |
| Latex Untersuchungshandschuhe | Adachi | ||
| MAS beschichtetes Objektträgerglas | Matsunami Glas | 83-1881 | Für Immunfärbung von Aggregaten |
| MicroAmp Fast 96-Well-Reaktionsplatte | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | 4346907 | Für RT-qPCR-Mikroskop |
| Olympus | CKX41N-31PHP | Für die Zellkultivierung | |
| Microtube Watoson | 131-515CS | ||
| Monoklonales Anti-Α-Fetoprotein | SIGMA | A8452 | Anti-AFP, × 1/200 Verdünnung |
| Nanodrop 8000 | Thermo Fisher Scientific | für RT-qPCR | |
| Oligo dT | FASMAC | Maßgeschneidertes Oligo | Für die RT-qPCR ist die Sequenz "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT" |
| Paraformaldehyd, Pulver | Nacalai tesque | 26126-54 | PFA, Fixiermittel, verdünnt in DPBS |
| Pharmazeutischer Kühlschrank | SANYO | MPR-514 | Für 4 ° C Lagerung |
| von PIPETMAN P | GILSON | Pipette | |
| Rekombinante humane KGF/FGF-7 | R& D Systems | 251-KG | KGF |
| Rekombinant Mensch Noggin | PeproTech | 120-10C | NOGGIN |
| Rekombinant Mensch/Maus/Ratte Aktivin A | R& D Systems | 338-AC | Activin A |
| ReverTra Ace (100 U/μ L) | TOYOBO | TRT-101 | Für RT-qPCR |
| RNase-freies DNase-Set (50) | QIAGEN | 79254 | Für RT-qPCR |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | Für RT-qPCR |
| RPMI 1640 mit L-Gln | Nacalai tesque | 30264-85 | RPMI 1640 |
| Versiegelungsfolie für Echtzeit | Takara | NJ500 | Für serologische RT-qPCR-Pipetten |
| 10 mL | Costar/Corning | 4488 | Für die Zellkultivierung |
| Serologische Pipetten 25 mL | Costar/Corning | 4489 | Für die Zellkultivierung |
| Serologische Pipetten 5 | mL Costar/Corning | 4487 | Für die Zellkultivierung |
| Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb | Zellsignalisierung | 3579S | Anti-SOX2, × 1/200 Verdünnung |
| StepOnePlus | Applied Biosystems/Thermo Fisher Wissenschaftlich | für RT-qPCR | |
| Saccharose | Nacalai tesque | 30406-25 | Für die Immunfärbung von Aggregaten |
| TB Green Premix Ex Taq II | Takara | RR820B | für RT-qPCR |
| TC20 Automatisierter Zellzähler | BIO-RAD | 1450101J1 | Automatischer Zellzähler |
| Tissue-Tek OCT Verbindung 4583 | Sakura Finetechnical | 4583 | Für die Immunfärbung von Aggregaten |
| Tissue-Tek Cryomold Formen/Adapter | Sakura Finetechnical | 4566 | Für die Immunfärbung von Aggregaten |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Trypan Blue | BIO-RAD | 1450021 | |
| Ultrakalter Gefrierschrank | SANYO | MDF-U33V | Für -80 ° C Lagerung |
| UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | DPBS verdünnen, um 0,5 mM EDTA |
| herzustellen Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | für RT-qPCR | |
| Y-27632 | Wako | 251-00514 |
Referenzen
- D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vi....
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Nachdrucke und Genehmigungen
