Neuartige Methode der Transport der Plasmid-DNA zu Maus Blase Urothel durch Elektroporation

Summary

Wir beschreiben eine neue Methode für die Lieferung von Plasmid DNA in die important-Zellen der Maus Blase in Vivo durch Katheterisierung der Harnröhre und Elektroporation. Freuen Sie sich auf eine schnelle und bequeme Möglichkeit zur Erzeugung von autochthonen Mausmodelle der Blase Krankheiten.

Abstract

Gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMMs) sind sehr wertvoll bei der Enthüllung neuartige biologische Einblicke in die Initiierung und Progression Mechanismen der menschlichen Krankheiten wie Krebs. Transgenen und bedingte Knockout-Mäusen werden häufig seit Überexpression des Gens oder Ablation in bestimmten Geweben oder Zellen in Vivo-Typen. Generierung von Keimbahn Mausmodellen kann Zeit- und kostenaufwändige jedoch. Neue Zuführungen in gen Bearbeiten von Technologien und die Machbarkeit liefern DNA Plasmide durch Virusinfektion haben schnelle Generierung von nicht Keimbahn autochthonen Mausmodellen Krebs für mehrere Organe aktiviert. Die Blase ist ein Organ, das für virale Vektoren aufgrund des Vorhandenseins einer Glykosaminoglykan Schicht deckt das Urothel Zugang zu schwierig gewesen sei. Hier beschreiben wir eine neuartige Methode, entwickelt im Labor für die effiziente Bereitstellung von DNA Plasmide in der Maus Blase Urothel in Vivo. Durch die intravesikale Instillation von pCAG-GFP DNA Plasmid und Elektroporation chirurgisch freigelegten Blase zeigen wir, dass das Plasmid DNA spezifisch in die Blase important Zellen für transiente Expression geliefert werden kann. Unsere Methode bietet eine schnelle und bequeme Möglichkeit für Überexpression und Knockdown von Gene in der Maus Blase und zum Aufbau von GEMMs von Blasenkrebs und anderen urologischen Krankheiten angewendet werden kann.

Introduction

Gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMMs) spielen eine wesentliche Rolle bei der Erweiterung unseres Wissens über TIERENTWICKLUNG, gen Funktionen in Vivound Mechanismen der Krankheit Fortschreiten^1,2. Keimbahn GEMMs werden traditionell in zweierlei Hinsicht entwickelt. Die erste ist die Schaffung von transgenen Mäusen durch man Injektion von DNA Plasmid, gefolgt von der Transplantation von Zygoten in pseudopregnant Weibchen. Die andere ist die Generierung von Knock-Out/Knock-in Mäusen durch homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen und die Entwicklung der Chimären. Bedingte ko von Genen in b....

Protocol

Alle hier beschriebene Verfahren wurden gemäß den Richtlinien und Verordnungen aus dem institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der University of California Santa Cruz durchgeführt.

(1) Plasmid und Vorbereitung der Werkzeuge

1. Für jede Blase zu transfizieren, mindestens 20 µL DNA Plasmid (1 µg/µL) vorzubereiten.
2. Die 20 µL Plasmid-Lösung in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch 1 µL Trypan blau hinzufügen. Pipette gut mischen.
3. Autoklav alle chirurgischen Instrumente und den Arbeitsbereich mit 70 % Ethanol zu sterilisieren. Sprühen von chirurgischen Instrumenten und Handschuhe mit 70 % Ethanol häu....

Results

Um den Erfolg der Gen-Lieferung in die Blase Urothel zu demonstrieren, haben wir die pCAG-GFP¹⁵ Plasmid für Elektroporation verwendet. 20 µL Plasmid und Trypan blau Lösung wurde durch die Harnröhre injiziert und 5 elektrische Impulse verabreicht wurden. Nach 48 h wir seziert die Maus Blase und Flecken von GFP Fluoreszenz unter dem Dissektion-Fluoreszenz-Mikroskop beobachtet, während eine Negative Kontrolle Blase, die nicht unterziehen Elektroporation zeigte kein GL.......

Discussion

Elektroporation verbessert die Durchlässigkeit der Zellmembran und ist eine leistungsstarke Technologie für gen-Electrotransfer-¹⁶. Gen-Lieferung in lebenden Nagetiere durch Elektroporation wurde häufig in der Neurobiologie Felder^{17,18,19,20,21}verwendet. Seine Anwendungsmöglichkeiten in vielen anderen Organen haben nicht ausgiebig erfor.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD 1mL TB Spritze	Fisher	148232E
Buprenorphin	Sigma	B9275-50MG
Dumont Pinzette	Roboz Surgical Instr	RS-5005	Behandeln Sie mit 70% Ethanol vor dem chirurgischen Gebrauch
ECM830 SQ Wave Elektroporator	Harvard Apparatus	450052
Exel International Einweg-Safelet IV-Katheter	Fisher Scientific	14-841-21	24G, 2,11 cm Länge, 0,045 cm Außendurchmesser
Extra feine Mikro-Präparierschere	Roboz Surgical Instr	RS-5135	Vor chirurgischer Anwendung mit 70% Ethanol behandeln
Isofluran	Vet one	501017
K& H Beheizte Ruhematte für Kleintiere, 9 x 12 Zoll	Amazon	n/a	Decken Sie die Heizmatte mit Papiertüchern
ab Augensalbe	Fisher	NC0849514
PBS, pH7,4	Life Technologies	10010049
Pipettenspitzen 200 & Mikro; L	USA Scientific	1111-0206
Pipettenspitzen, universelle Passform; 0,1 bis 10 & Mikro; L	Fisher	02707438(CS)
PIPETMAN NEO P2	Gilson	F144561
PIPETMAN NEO P200N	Gilson	F144565
Plasmid CAG-GFP	Addgene	16664
Platinum Pinzette 5 mm	Harvard Apparat 450489		5 mm
Durchmesser Schere	Roboz Surgical Instr	RS-5880	Behandeln mit 70% Ethanol vor dem chirurgischen Gebrauch
String	Cord Amazon	n/a	Mandala Crafts 150D 210D 0,8mm 1mm Leder Nähen Flach gewachst Faden String Cord
Tape, Scotch	Fisher	19047257
Therio-Gel Veterinary Lubricant	PBS Tiergesundheit	353-736
Trypan Blue Stain	Life Technologies	15250061
V-1 Tischplatte Systemanästhesie	VetEquip	901806
Vicryl violett Naht 18" FS-2 Schneiden 5-0	Fisher	NC0578475
Walgreens Povidon Jod 10%	Walgreens	953982
Wundclip	Fisher	018045
Wundclip applier	Fisher	01804