Korrekturlesen und DNA-Reparatur-Assay mit Einzel-Nukleotid-Erweiterung und MALDI-TOF Massenspektrometrie-Analyse

Zusammenfassung

Eine nicht beschriftet, nicht-Radio-Isotopen Methode zur DNA-Polymerase Korrekturlesen und eine DNA-Reparatur-Assay wurde mithilfe von hochauflösenden MALDI-TOF-Massenspektrometrie und eine Einzel-Nukleotid-Erweiterung-Strategie entwickelt. Der Test erwies sich als zu sehr spezifischen, einfache, schnelle und einfach durchzuführen, für das Korrekturlesen und reparieren kürzer als 9-Nukleotide patches.

Zusammenfassung

Die Wartung des Genoms und seine treuen Replikation ist von größter Bedeutung für die Erhaltung der genetischen Information. Um High-Fidelity-Replikation zu bewerten, haben wir eine einfache, nicht beschriftet und nicht-Radio-Isotopen-Methode mit einer Matrix-assisted Laser Desorption ionisation mit Time-of-Flight (MALDI-TOF) Masse Massenspektrometrie (MS)-Analyse für ein Lektorat Studie. Hier, eine DNA-Polymerase [z. B. das Klenow-Fragment (KF) von Escherichia coli DNA-Polymerase ich (Pol ich) in dieser Studie] in Anwesenheit aller vier Dideoxyribonucleotide Triphosphate wird verwendet, um eine nicht übereinstimmende Grundierung-Vorlage Maisonette verarbeiten. Die nicht übereinstimmende Grundierung ist dann erweitert/Korrekturlesen und MALDI-TOF MS unterzogen. Die Produkte zeichnen sich durch die Massenänderung der Grundierung auf Einzel-Nukleotid-Variationen. Wichtig ist, kann eine Korrektur auch für interne einzelnen Fehlanpassungen, wenn auch mit unterschiedlicher Effizienz ermittelt werden. Fehlanpassungen gelegen in 2-4-Nukleotide (nt) von 3'-Ende waren effizient Korrekturlesen von Pol ich, und ein Missverhältnis bei 5 nt von der Grundierung Endstation zeigte nur eine partielle Korrektur. Keine Korrektur erfolgte für interne Konflikte am 6-9 nt vom Primer 3' Ende. Diese Methode kann auch zur DNA-Reparatur-Assays (z. B. Beurteilung eine Basis-Läsion Reparatur von Substraten für den Endo V Reparatur Weg) angewendet werden. Primer mit 3' vorletzten Deoxyinosine (dI) Läsionen durch Pol korrigiert werden könnte ich. In der Tat vorletzten T-I, G-I und A-ich Substrate hatte ihre letzte 2 dI-haltigen Nukleotide herausgeschnitten von Pol ich vor dem Hinzufügen eines richtigen DdN 5'-Monophosphate (DdNMP) beim vorletzten C-ich Diskrepanzen wurden toleriert, von Pol I, so dass die Grundierung ohne erweitert werden Reparatur, zeigen, dass die Empfindlichkeit und Auflösung der MS Test zur Messung der DNA-Reparatur.

Einleitung

Die Korrekturlesen Funktionen von DNA-Polymerasen während der DNA-Replikation sind Voraussetzung für High-Fidelity der genetischen Information, die auf Nachkommen^{1,2,3,4übertragen werden muss, 5,6,7}. Um die Beiträge der Polymerase Korrekturlesen exonucleasen beurteilen würde die Mechanismen, die Sicherung der genetischen Stabilität klären.

Kennzeichnung von Radioisotopen und Gel-basierte Assays in Kombination ....

Protokoll

(1) Primer/Vorlage Vorbereitung

1. Entwerfen Sie Grundierungen/Vorlagen mit einem ausgewogenen G + C-Gehalt zwischen 40 % und 60 % wie in einem Sequenzierung oder PCR besser gekleideteres Design. Verwenden Sie Primer von 18 bis 21 nt für eine entsprechende glühen und bessere MS-Signale.
2. Designvorlage von 50 ° C einstellen, als das Minimum, die Schmelztemperatur der duplex Region mit mindestens 7 nt des 5'-Überhangs, die Signale zwischen den Primer und die Vorlage zu trennen.
   Hinweis: zum Beispiel für das Substrat P21/T28 in Tabelle 121-nt-Grundierung mit einer 28-nt-Vorlage paart. Option: die Verwendung von alternativen Nukleinsäur....

Ergebnisse

Vorlagen und Grundierungen:

Mithilfe des Verfahrens präsentiert hier gleich molare synthetisches Oligonukleotid-Vorlagen und Primer der entsprechenden Sequenzen aus kommerziellen Quellen gewonnen wurden überprüft, für Reinheit und Qualität (Abbildung 3A; beachten Sie, dass die Signale die angegebene Masse abgestimmt und dem niedrigen Hintergrund) als auch für die Beziehung zwischen .......

Diskussion

Diese Studie beschrieben einen Schritt für Schritt Korrekturlesen Tätigkeit Assay von der gewählten kommerziellen Instrument analysiert (siehe die Tabelle der Materialien) mit MALDI-TOF MS. Die großen Vorteile sind, dass die Grundierung und Vorlage Etikett kostenlos und einfach zu führen, ermöglicht größere Flexibilität bei der Versuchsplanung. Ein Stream-Kalk vollständige Verarbeitung von 30 Korrekturlesen Tests 4 h, 3 h beim manuellen Abgleich der Korrekturlesen Reaktionen einschließlich nehmen würde u.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Oligonukleotide	Mission Biotech (Taiwan)
phosphorothioat-modifizierte Oligonukleotide	Integrated DNA Technologies (Taiwan)
DNA-Polymerase I, großes (Klenow) Fragment	New England Biolabs, MA	M0210L
Klenow-Fragment (3'→ 5' exo-)	New England Biolabs, MA	M0212L
NEBuffer 2.1 (10X)	New England Biolabs, MA	B7202S
2', 3' ddATP	Trilink Biotechnologies, CA	N4001
2', 3' ddGTP	Trilink Biotechnologies, CA	N4002
2', 3' ddTTP	Trilink Biotechnologies, CA	N4004
2', 3' ddCTP	Trilink Biotechnologies, CA	N4005
dATP, dGTP, dCTP, dTTP set	Clubio, Taiwan	CB-R0315
SpectroCHIP Array	Agena Bioscience, CA	#01509
MassARRAY	Agena Bioscience, CA
Typer 4.0 Software	Agena Bioscience, CA	#10145
Clean Resin Tool Kit	Agena Bioscience, Kalifornien#	08040