Caenorhabditis Tamiz: Un instrumento de baja tecnología y metodología para la clasificación de los organismos multicelulares pequeños
Summary
El protocolo actual incluye una metodología para la clasificación y limpieza de las poblaciones de edad comparable de elegans de Caenorhabditis. Utiliza un simple, barato y eficaz herramienta a la medida para obtener una población experimental de nematodos para la investigación.
Abstract
Elegans de Caenorhabditis (C. elegans) es un organismo modelo bien establecido usado en una amplia gama de investigación básica y biomédica. Dentro de la comunidad de nematodos de la investigación, hay una necesidad de una forma asequible y eficaz mantener poblaciones grandes, edad comparable de C. elegans. Aquí, presentamos una metodología para la clasificación mecánica y limpieza C. elegans. Nuestro objetivo es proporcionar un proceso rentable, eficiente, rápido y simple para obtener animales de tamaños uniformes y estadios para su uso en experimentos. Esta herramienta, el tamiz de Caenorhabditis , utiliza un sistema de tapa a la medida que los hilos de rosca en tubos de laboratorio cónico común y tipo C. elegans basado en tamaño de cuerpo. También demostramos que el tamiz de Caenorhabditis efectivamente transfiere animales de placa de un cultivo a otro lo que permite una rápida clasificación, sincronización y limpieza sin afectar a los marcadores de salud, incluyendo la movilidad e inducible por estrés Reporteros de gene. Esta herramienta accesible e innovador es una opción rápida, eficiente y no estresante para el mantenimiento de las poblaciones de C. elegans .
Introduction
El gusano nematodo Caenorhabditis elegans, es un organismo modelo principal. Además de la naturaleza sencilla y controlada de su cultivo en el laboratorio, es de su genoma completo secuenciado1 y el destino del desarrollo de cada célula se conoce2. Debido a estas características, C. elegans es un organismo modelo ampliamente utilizado para los estudios genéticos. Sin embargo, junto con estas características beneficiosas vienen algunos desafíos para los investigadores. Debido a su tiempo de generación rápido, las poblaciones de C. elegans pueden quedarse rápidamente sin alimentos o mezcladas poblaciones con múltiples generaciones y etapas de desarrollo se presentan a la vez. Por lo tanto, experimentos llevados a cabo en medios del sólido crecimiento de nematodos (NGM) requieren investigadores moverse físicamente animales a platos frescos antes de agota la fuente bacteriana de alimentos y desarrollan de nuevas larvas. Esto puede ser tedioso como una transferencia frecuente de los animales es necesaria para evitar que las poblaciones experimentales de ser mezclado con generaciones de crías. Aún así, algunos experimentos requieren ambos números grandes de animales y puntos de tiempo prolongado (por ejemplo, la extracción de DNA o RNA en la edad adulta). Esto agrava los retos de mantener una población sincronizada con precisión y transferir grandes cantidades de animales.
Los métodos actuales de transferencia de C. elegans cultivadas el NGM se cosecha o lavar los animales placa; tratando químicamente los animales (por ejemplo, con la replicación de ADN inhibidor fluorodeoxyuridine o FUDR); o mediante citometría de flujo para clasificar los animales en placas de varios pocillos. Selección implica el uso de una herramienta de mano, hecha con un alambre fino de platino o una pestaña, a transferir manualmente individuales o múltiples animales3,4. Este método es exacto, pero requiere habilidad y tiempo y es una limitación para estudios con gran número de animales. Cosecha de mayo también ser físicamente perjudiciales y estresante para los animales potencialmente someter a individuos a cantidades inconsistentes y antinaturales del disturbio y de fuerza. Lavado consiste en enjuagar una placa de cultivo con una solución tampón y transferir la solución con los animales con pipeta Pasteur de vidrio a una placa de cultivo nuevo. Este método es rápido y eficiente pero no es exacto como múltiples generaciones y etapas de desarrollo de los animales se transfieren a granel. Tratamientos químicos, tales como FUDR, pueden ser disuelto en los medios de cultivo para evitar la producción de descendencia a través del bloqueo de cualquier réplica de la DNA y por lo tanto, el desarrollo de la producción y huevos de gametos. Si bien efectivo, este método debe ser aplicado después de la maduración del desarrollo en cuanto a no alterar los procesos normales de desarrollo, y esto significa que aún es un requisito para la transferencia de los animales antes de su administración3. Este método también influencias múltiples celular vías de señalización, dando por resultado efectos notables sobre los animales a medida que envejecen (p. ej., una extensión de vida útil o una alterada proteostasis) dependiendo de la cepa de C. elegans utilizadas5, 6,7,8,9,10. Métodos de citometría de flujo automáticamente clasificar y transferir individual C. elegans de una placa de un bien a otro11. Si bien este método es muy eficaz y eficiente, equipos de citometría de flujo es prohibitivamente costoso e inaccesible para muchos investigadores. Una alternativa a la transferencia de animales es usar modelos mutantes termosensible, como fer-15 fem-1, que se convierten en estériles con ajuste de temperatura12. Mientras que el uso de animales mutantes es útil en algunas situaciones, estas cepas específicas crecen más lentamente que los animales de tipo silvestre y dependen de un genoma alterado, que sirve como representantes pobres gusanos envejecimiento o sano. Además, la dependencia de un cambio de temperatura para inducir esterilidad también resulta en la ausencia de un entorno estático, y los cambios de temperatura han demostrado fácilmente influir gene expresiones13,14, 15. grupos de investigación anteriormente han publicado técnicas que describe el uso de una malla para filtrar C. elegans por tamaño16. Sin embargo, hemos podido encontrar trabajo previo para cualquier cambio en los resultados generales de salud que pueden estar asociados con el uso de estos filtros.
Por lo tanto, es una necesidad dentro de la comunidad de investigación de C. elegans para un método asequible, eficiente, rápido y preciso para la transferencia de grandes cantidades de animales entre placas. Hemos desarrollado una pieza accesible, mejora de equipo (nombrado el tamiz de Caenorhabditis ) y un protocolo asociado para su fabricación y funcionamiento que satisfaga las necesidades de la comunidad de investigación de C. elegans . Aquí, compartimos el diseño de la criba de Caenorhabditis y métodos para su uso, y nos demuestran que su uso no afecta la salud común o cualquier marcador de estrés en comparación con la cosecha manual estándar y un tratamiento con el uso común, restricción de fertilidad química FUDR.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este documento, presentamos el diseño y el uso del tamiz de Caenorhabditis accesible, eficaz como herramienta para ordenar y mantener la C. elegans. Esta herramienta tiene varias ventajas para escoger manualmente cada animal, el lavado de las poblaciones, tratamientos químicos (p. ej., FUDR) y más costosos métodos de segregación de animales. En primer lugar, el Caenorhabditis tamiz de forma eficiente y rápida (menos de 20 min) clases descendientes de grandes poblaciones mixtas…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Heather Currey por su contribución inicial para el diseño del estudio y el Dr. Swarup Mitra por su revisión crítica del manuscrito. También nos gustaría agradecer al Dr. Michael B. Harris comentarios, refinamientos y asistencia en la producción de la demostración de esta metodología. Las cepas fueron proporcionadas por el centro de genética de Caenorhabditis, que está financiado por la oficina de NIH de investigación programas de infraestructura (P40 OD010440). La investigación en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de General médica Ciencias de los institutos nacionales de salud, bajo la concesión número UL1GM118991, TL4GM118992 o RL5GM118990 y por un premio institucional de desarrollo (IDeA) de el Instituto Nacional de General médica Ciencias de los institutos nacionales de salud bajo la concesión número 5P20GM103395-15. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud. UA es un empleador de AA/EO y la institución educativa y prohíbe la discriminación ilegal contra cualquier persona: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination.
Materials
| Safety glasses | Uline | S-21076 | |
| Protective heat resistant glove | Grainger | Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 14-432-22 | |
| Synthetic Nylon mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd |
NTX20 and NTX50 | |
| Cyanoacrylate glue | Scotch Super Glue Liquid | SAD114 | |
| Pliers | Vampliers | VMPVT-001-8 | |
| Dremmel tool with circular file | Lowe's | Item # 525945 Model # 100-LG | |
| FUDR | Sigma | F0503 | |
| M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4) | Sigma | S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506 | |
| NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin) | BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest) | BD bioscience 211677, Lab Express 1001, Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | |
| Paraquat dichloride hydrate | Sigma | 36541 | |
| Inverted fluorescence microscope | Olympus | FSX100 |
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