Wir haben einen einfachen und anpassungsfähigen Workflow zur Fluoreszenz-Imaging-basierte zellbiologischen Studien Proteinaggregation und selbstverdauende Fluss in das zentrale Nervensystem der Drosophila -Modelle von quantitativen Daten entlocken entwickelt. Neurodegeneration.
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Methodenartikel
Quantitative Zellbiologie der Neurodegeneration in Drosophila durch unvoreingenommene Analyse der Gewebekulturen Tagged Proteine mit ImageJ
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Mit der steigenden Verbreitung von neurodegenerativen Erkrankungen ist es zunehmend wichtig, die zugrunde liegende Pathophysiologie zu verstehen, die zu neuronalen Dysfunktion und Verlust führt. Fluoreszenz-imaging-Tools und Technologien ermöglichen beispiellose Analyse der subzellulären neurobiologischen Prozesse, doch gibt es noch eine Notwendigkeit für Objektive, reproduzierbare und zugänglich Ansätze zur Extraktion von quantifizierbaren Daten aus bildgebenden Verfahren . Wir haben einen einfachen und flexiblen Workflow um quantitative Daten von Fluoreszenz basierende bildgebenden Studien mit Drosophila Modelle der Neurodegeneration zu extrahieren entwickelt. Im einzelnen beschreiben wir einen easy-to-Follow, halbautomatischen Ansatz mit Fidschi/ImageJ um zwei zelluläre Prozesse zu analysieren: Erstens quantifizieren wir aggregierte Proteingehalt und Profil in der Drosophila -Optik-Lappen mit Leuchtstoff-Tags Mutant Huntingtin-Proteine; und zweitens bewerten wir Autophagie-Lysosomen Flussmittel in Drosophila visuellen Systems mit ratiometrischen basierende Quantifizierung der fluoreszierenden Tandem Reporter der Autophagie. Wichtig ist, enthält das Protokoll hier skizzierten einen semi-automatischen Segmentierung Schritt um sicherzustellen, dass alle fluoreszierende Strukturen analysiert werden, um Selektionsbias zu minimieren und Auflösung der subtilen Vergleiche zu erhöhen. Dieser Ansatz für die Analyse von anderen biologischen Zellstrukturen erweitert werden kann und Prozesse verwickelt in Neurodegeneration, wie proteinhaltige Puncta (Stress-Granulat und synaptischen komplexe), sowie Membrane-springen Fächer (Mitochondrien und Menschenhandel membranvesikel). Diese Methode bietet eine standardisierte, noch anpassbar Referenz für Bildanalyse und Quantifizierung, und könnte Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit über das Feld erleichtern, und letztlich mechanistisches Verständnis der Neurodegeneration verbessern.
Einleitung
Neurodegenerative Erkrankungen betreffen Millionen von Menschen jedes Jahr und die Häufigkeit nimmt mit einer alternden Bevölkerung1. Während jeder Neurodegenerative Erkrankung hat eine einzigartige Ätiologie, zeichnen Aggregation fehlgefaltete Proteine und Aufschlüsselung des proteostase Netzwerks gemeinsame pathologische viele dieser Krankheiten. Erläuterung, wie die Störung dieser grundlegenden und zusammenhängende Prozesse schief geht ist als Beitrag zu neuronalen Dysfunktion und Zelle Tod entscheidend für Verständnis neurodegenerativen Erkrankungen sowie therapeutische Interventionen führen. Fluoreszenz-basierte Bildgebung ermöglicht eine ....
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Protokoll
1. Überlegungen und Vorbereitungen für die Gestaltung von Bild-Analyse-Experiment
- Vorherbestimmen Sie geeignete anatomische, Mobilfunk oder subzellulären Markierungen dienen als Wahrzeichen für die Standardisierung einer Region of Interest (ROI) über verschiedene Proben, z. B. 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI), Membran-Marker, lokalisierte Leuchtstofflampen Protein, etc.
- Wählen Sie einen fluoreszierenden Marker, der diskrete Puncta jenseits Hintergrundkonzentrationen für die Struktur des Interesses abgrenzen kann.
Hinweis: Dieses Protokoll ist für proteinhaltige Strukturen (z.B. fehlgefaltete Protein-Aggregate) und Membran....
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Ergebnisse
Quantifizierung der Anzahl, Fläche und Intensität der Gewebekulturen tagged mutierten Htt-Aggregate in der Drosophila -Optik-Lappen
Fehlgefaltete Proteinaggregation in das zentrale Nervensystem eine Drosophila -Modell der Huntington-Krankheit, RFP-Tags Mutant untersuchen menschliche Htt mit einem nicht-pathologischen (FH-RFP-hHttQ15) oder pathologische Erweiterung ( UAS-RFP-hHttQ138) und Membran .......
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Diskussion
Die hier beschriebene Protokoll lässt sich vehement und reproduzierbar quantitate Zelle biologische Prozesse visualisiert durch Fluoreszenz-basierte Bildgebung. Zusammenhang mit biologischen und technischen Einschränkungen müssen sorgfältig geprüft werden, um das experimentelle Design führen. Fluoreszierenden Marker der subzellulären Strukturen von Interesse, ob immunhistochemische, farbstoffbasierte oder genetisch ausgedrückt, müssen über Hintergrund von Morphologie und Intensität unterscheiden. FH/GAL4 -System.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Diese Arbeit wird unterstützt durch die Sheila und David Fuente neuropathischen Schmerzen Forschung Programm Graduate Fellowship (zu J.M.B.), Lois Pope LIFE Fellows Programm (, C.L., Y.Z und J.M.B.), die Snyder-Robinson Foundation Predoctoral Fellowship (zu cl), Dr. John T . Macdonald Foundation (CL), Verträge, Bewilligungen von der National Institutes of Health (NIH) HHSN268201300038C, R21GM119018 und R56NS095893 (zu R.G.Z.), und von Taishan Gelehrter Project (Provinz Shandong, Volksrepublik China) (R.G.Z.).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| SYLGARD(R) 184 Silikon-Elastomer-Kit | Dow Corning Corporation | PF184250 | Sezierschale |
| Falcon 35 mm nicht TC-behandelt Easy-Grip Style Bakteriologische Petrischale | Corning | 351008 | Sezierschale |
| Dumont #5 Pinzette | Fine Science Tools | 11251-20 | Sezierwerkzeug |
| Natriumchlorid | Sigma | S3014 | PBS-Lösung |
| Natriumphosphat zweibasisch | Sigma | S5136 | PBS-Lösung |
| Kaliumphosphat Monobasisch | Sigma | P5655 | PBS-Lösung |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Wasch- und Antikörper-Inkubationslösung. |
| 37% Formaldehyd | VWR | 10790-710 | |
| Einweg-Mikrozentrifugenröhrchen zur Fixierung (0,5 ml, blau) | VWR | 89000-022 | Fixierungs-, Wasch- und Antikörperinkubation. |
| Glatte und mattierte Mikro-Objektträger (25-fach; 75mm) | VWR | 48312-004 | Objektträger für die konfokale Bildgebung |
| Micro Cover Gläser, rechteckig (22 fach; 40mm) | VWR | 48393-172 | Objektträger für konfokale |
| Bildgebung Gummi Zement | Schleim | 1051-A | Halterung |
| VECTASHIELD Antifade Eindeckmedium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Montage |
| Scotch Magic 810 Unsichtbares Klebeband (19mm&mal; 25.4m) | 3M Company | 810 | Montage |
| Normales Ziegenserum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | Antikörper-Inkubaton |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Nukleinsäure-Färbung. In entionisiertem Wasser auflösen, um eine 5 mg/ml-Stammlösung herzustellen, und bei -80 °C lagern. Auf eine Arbeitskonzentration von 10-20 μm verdünnen; g/mL in PBTx. |
| 3,5X-90X Stereo-Zoom-Inspektion Industriemikroskop | AmScope | SM-1BNZ | Dissektions-Oszilloskop. Ausgestattet mit 6W LED Dual Schwanenhalsbeleuchtung |
| ImageJ/Fiji | NIH | v1.51u | Mit SCF_MPI_CBG Plugins (Version 1.1.2) |
| FV1000-IX81 Konfokal-Laser-Scanning-Mikroskop | Olympus | ||
| Recombinant Construct | Bloomington Drosophila Stock Center | BL37749 |
Referenzen
- Erkkinen, M. G., Kim, M. -O., Geschwind, M. D. Clinical Neurology and Epidemiology of the Major Neurodegenerative Diseases. Cold Spring Harbor perspectives in biology. , a033118(2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-imag....
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Nachdrucke und Genehmigungen
