Ausdruck von fluoreszierenden Fusionsproteinen in murinen Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen und Makrophagen

Zusammenfassung

In diesem Artikel liefern wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für den Ausdruck von fluoreszierenden Fusionsproteinen in murinen Knochenmark dendritische Zellen und Makrophagen abgeleitet. Die Methode basiert auf der Transduktion des Knochenmarks Stammväter mit retroviralen Konstrukten gefolgt von Differenzierung in Makrophagen und dendritischen Zellen in Vitro.

Zusammenfassung

Dendritische Zellen und Makrophagen sind wichtige Zellen, die die erste Linie der Verteidigung gegen Krankheitserreger bilden. Sie spielen auch eine wichtige Rolle bei der Initiierung einer adaptiven Immunantwort. Experimenteller Arbeit mit diesen Zellen ist sehr anspruchsvoll. Ihre Fülle in Organen und Geweben ist relativ gering. Infolgedessen können nicht sie in großer Zahl isoliert werden. Sie sind auch schwer zu transfizieren mit cDNA-Konstrukten. Im Mausmodell können diese Probleme teilweise durch in Vitro Differenzierung von Knochenmark Vorläufern im Beisein von M-CSF für Makrophagen oder GM-CSF für dendritische Zellen überwunden werden. Auf diese Weise ist es möglich, große Mengen dieser Zellen von sehr wenigen Tieren zu erhalten. Darüber hinaus können Knochenmark Stammväter mit retroviralen Vektoren tragen cDNA-Konstrukte in frühen Phasen des Anbaus vor deren Differenzierung in Knochenmark abgeleitet dendritische Zellen und Makrophagen ausgestrahlt werden. So kann retrovirale Transduktion gefolgt von in-vitro- Differenzierung verwendet werden, verschiedene cDNA-Konstrukte in diesen Zellen zum Ausdruck bringen. Die Fähigkeit, ektopische Proteine deutlich auszudrücken reicht das Verbreitungsgebiet von Experimenten, die auf diese Zellen, einschließlich live Cell Imaging von fluoreszierenden Proteinen, Tandem Reinigungen für Interaktom Analysen, Struktur-Funktionsanalyse durchgeführt werden können, Überwachung der Zellfunktionen mit Biosensoren und viele andere. In diesem Artikel beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für retrovirale Transduktion von murinen Knochenmark abgeleitet dendritischen Zellen und Makrophagen mit Vektoren für Gewebekulturen getaggt Proteine codieren. Am Beispiel von zwei Adapter-Proteine, OPAL1 und PSTPIP2, zeigen wir die praktische Anwendung in Durchflusszytometrie und Mikroskopie. Wir diskutieren auch die Vorzüge und Grenzen dieses Ansatzes.

Einleitung

Myeloische Zellen sind einen unverzichtbaren Bestandteil unserer Abwehrmechanismen gegen Krankheitserreger. Sie sind in der Lage, schnell Mikroben sowie sterbenden Zellen zu beseitigen. Darüber hinaus engagieren sie sich auch bei der Regulierung der Gewebeentwicklung und Reparatur und bei der Aufrechterhaltung der Homöostase^1,2,3. Alle myeloische Zellen unterscheiden sich von gemeinsamen myeloischen Vorläuferzellen im Knochenmark. Ihre Differenzierung in vielen funktionell und morphologisch unterschiedlichen Teilmengen ist zu einem großen Teil durch Zytokine und ihre verschie....

Protokoll

Alle hier beschriebene Methoden wurden durch den Sachverständigenausschuss für die Wohlfahrt der Versuchstiere des Instituts für molekulare Genetik und der Akademie der Wissenschaften der Tschechischen Republik zugelassen.

(1) Reagenz Vorbereitung

1. Bereiten Sie den Puffer Ammonium-Chlorid-Kalium (ACK). 500 mL DdH₂O, fügen Sie 4,145 g NH₄Cl und 0,5 g KHCO_{3 hinzu} dann fügen Sie 100 µL 0,5 M Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA hinzu) und sterilisieren Sie Filter zu.
2. Bereiten Sie Polyethylenimine (PEI) Lösung. 90 mL DdH₂O. 0,1 g von PEI hinzufügen Fügen Sie unter Rühren 1 M HCl t....

Ergebnisse

Signalproteine Adapter sind in der Regel kleine Proteine ohne enzymatische Aktivität. Sie besitzen verschiedene Interaktion Domänen oder Motive, die Bindung an andere Proteine vermitteln beteiligt Signaltransduktion, einschließlich Tyrosin-Kinasen und Phosphatasen, Ubiquitin Ligases²¹. Für die Demonstration der Funktionalität dieses Protokolls wurden myeloid Zellen-Adapter PSTPIP2 und OPAL1 ausgewählt. PSTPIP2 ist ein gut charakterisierten Protein an der Regulation.......

Diskussion

Der Ausdruck des Proteins des Interesses an Zielzellen ist ein wichtiger Schritt in vielen Arten von biologischen Studien. Differenzierte Makrophagen und dendritischen Zellen sind schwer zu transfizieren standard Transfektion und retrovirale Transduktion Techniken. Unter Umgehung der Transfektion von diesen differenzierten Zellen mit retrovirale Transduktion von Knochenmark Vorläufern, gefolgt von Differenzierung, wenn sie bereits das gewünschte Konstrukt tragen ist ein entscheidender Schritt, so dass des Ausdrucks der e.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DMEM	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	15028
Fötales Rinderserum (FBS)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	10270	Zur Unterstützung durch die Medien
KHCO3	Lachema, Brno, Tschechische Republik	N/A
NH4Cl	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	A9434
Penicillin	BB Pharma AS, Prag, Tschechische Republik	N/A	PENICILIN G 1,0 DRASELNÁ SOL' BIOTIKA
Streptomycin	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	S9137	Streptomycinsulfat Salzpulver
Gentamicin	Dr. Kulich Pharma, Hradec Krá lové, Tschechische Republik	N/A
Polyethylenimin, linear, MW 25.000	Polyscience, Warrington, PA, USA	23966
Polybrene	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	H9268
EDTA	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	E5134
PBS	Eigenproduktion durch Medieneinrichtung der IMG ASCR, Prag, Tschechische Republik	N/A
APC Anti-Maus/humaner CD11b Antikörper, Klon M1/70	BioLegend (San Diego, CA, USA)	101212	Durchflusszytometrie
PE Anti-Maus F4/80 Antikörper, Klon BM8	BioLegend (San Diego, CA, USA)	123110	Durchflusszytometrie
Analyse APC Anti-Maus CD11c Antikörper, Klon N418	BioLegend (San Diego, CA, USA)	117310	Durchflusszytometrie
Analyse M-CSF	PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)	315-02
GM-CSF	PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)	315-03
Hoechst 33258	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	H1398	Durchflusszytometrie-Analyse Verwendung bei 1-2 &Mikro; g/mL