Vi beskriver metoder for å isolere hjørnetann nøytrofile fra hele blod og visualisere netto formasjon i live nøytrofile bruker fluorescens mikroskopi. Også beskrevet er protokoller å kvantifisere netto dannelse og citrullinated histone H3 (citH3) uttrykk med immunofluorescence mikroskopi.
Svar på invaderende patogener, slipp nøytrofile nøytrofile ekstracellulære feller (nett), som er ekstracellulære nettverk av DNA dekorert med histones og antimikrobielle proteiner. Overdreven netto dannelse (NETosis) og citH3 utgivelse i sepsis er tilknyttet flere orgel dysfunksjon og dødelighet i mus og mennesker, men konsekvensene i hunder er ukjent. Her, beskriver vi en teknikk for å isolere hjørnetann nøytrofile fra fullblod for observasjon og kvantifisering av NETosis. Leukocytter-rich plasma, generert av dekstran sedimentering, deles av kommersielt tilgjengelig tetthet gradert separasjon media og granulocytter samlet antall og levedyktighet testing. For å observere sanntid NETosis i live nøytrofile, legges cellen permeant og celle impermeant fluorescerende nukleinsyre flekker til nøytrofile aktivert lipopolysakkarid (LPS) eller phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Endringer i kjernefysiske morfologi og netto formasjon er observert over tid ved fluorescens mikroskopi. In vitro NETosis er mer preget av co-colocalization av celle-gratis DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) og citrullinated histone H3 (citH3) bruker en modifisert dobbel-immunolabelling-protokoll. Å objektivt kvantifisere netto dannelse og citH3 uttrykk med fluorescens mikroskopi, garn og citH3-positive celler er kvantifisert på forblindet måte med tilgjengelig programvare. Denne teknikken er en bestemt analysen vurdere i vitro kapasiteten av hjørnetann nøytrofile å gjennomgå NETosis.
Nøytrofile er kortvarige granulocytter ansvarlig for det første forsvaret mot invaderende patogener. Nøytrofile, rekruttert til området av smitte, eliminerer mikroorganismer fagocytose, omfatter degranulering og generasjon av reaktive oksygen arter (ROS)1. I nærvær av bakterier eller endotoxins dekorert nøytrofile utgivelsen nøytrofile ekstracellulære feller (nett), består av ekstracellulære chromatin med histones og detaljert proteiner som elastase og myeloperoxidase (MPO)2. Selv om garn har uunnværlig antimikrobielle egenskaper, antyder øke experimental og klinisk bevis at overivrig netto formasjon under sepsis kan føre til flere orgel dysfunksjon og død3,4, 5 , 6.
Fordi garn kan spille en liknende patofysiologiske rolle i hunder, kan terapeutisk intervensjon som forhindre eller redusere netto formasjon tjene som ny behandling strategier i septisk dyr. Derfor er det behov for en pålitelig teknikk for å vurdere og kvantifisere NETosis og netto komponenter i hundene. NET komponenter, inkludert celle-gratis DNA (cfDNA) og nucleosomes har tidligere blitt evaluert i hjørnetann nøytrofile og plasma klinisk hundene7,8,9. Bruker fluorescens analyser, fant Goggs og Letendre at septisk hunder har høyere nivåer av cfDNA enn rask hundene8. Selv om disse teknikkene er svært objektive og kvantitativ, er måling av cfDNA og nucleosomes som angir NETosis uspesifisert siden de kan utledes fra nekrotisk celler enn NETosing nøytrofile. Her beskriver vi en teknikk som bruker fluorescens mikroskopi for å undersøke atferd av live NETosing nøytrofile. Vi har også detalj en endret protokoll med dobbel-immunolabeling subjektivt kvantifisere garn og deres komponenter som MPO og citH3 i hjørnetann nøytrofile10.
Vi presenterer her en protokoll for å observere endringene i kjerner conformation og cfDNA utgivelse i levende hjørnetann nøytrofile med både en celle permeant fargestoff og en celle impermeant fargestoff. Den største fordelen med denne analysen er at det tillater for sanntids deteksjon av netto dannelsen av høy oppløsning mikroskopi i live nøytrofile uten celle fiksering, derfor gir et enkelt og nyttig verktøy for å observere i vitro netto formasjon. Siden denne analysen ikke krever antistoffer for p?…
The authors have nothing to disclose.
Tilsvarende forfatter ble finansiert av Morris dyr Foundation (D15CA-907). Studien ble støttet av midler fra University of California, Davis, senter for Equine helse og senter for følgesvenn dyr sunnhet (2016-24-F). Forfatterne ønsker å erkjenne Geena Ng for henne hjelp med tall og Nghi Nguyen for henne hjelp med video.
Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma | 31392 | Molecular weight 450,000 – 650,000 |
Ficoll-Paque PLUS | GE Life Sciences | 17144002 | |
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | A1285801 | With divalent cations |
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190136 | Without divalent cations |
E. coli O55:B5 | InvivoGen | ||
SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S11368 | 5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes |
SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7578 | 1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes |
Surface-Amps NP-40 | Pierce | 28324 | |
Poly-D-Lysine coated coverslips | neuVitro | H-12-pdl | 12 mm diameter |
Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments | Jackson ImmunoResearch | 111-007-003 | Specificity: IgG (H+L) |
Anti- Myeloperoxidase antibody | Dako | A0398 | |
4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 |