أسلوب ثقافة الدانية لدراسة Paracrine الإشارات بين الخلايا
Summary
باراكريني وجوكستاكريني من التفاعلات الخلوية دوراً هاما في العديد من العمليات البيولوجية، بما في ذلك تطور الورم والاستجابات المناعية، والأوعية، والتنمية. هنا، يستخدم أسلوب ثقافة الدانية لدراسة الإشارات paracrine حيث يتم الاحتفاظ تركيزات مترجمة من العوامل التي يفرزها مع منع الاتصال الخلوية مباشرة.
Abstract
التفاعلات بين الخلايا دوراً هاما في العديد من العمليات البيولوجية، بما في ذلك تطور الورم والاستجابات المناعية، والأوعية، والتنمية. باراكريني أو إشارات جوكستاكريني يتوسط هذه التفاعلات. استخدام وسيلة مكيفة ودراسات كوكولتوري هي الأساليب الأكثر شيوعاً للتمييز بين هذين النوعين من التفاعلات. ومع ذلك، أثر المترجمة تركيزات عالية من عوامل المكروية يفرزها أثناء التفاعلات paracrine لا موجز لها بدقة بواسطة مكيفة، وبالتالي، قد يؤدي إلى نتائج غير دقيقة. للتغلب على هذه المشكلة، وضعنا أسلوب ثقافة الدانية لدراسة الإشارات باراكريني. وتزرع أنواع الخلايا اثنين على السطح أما لغشاء البولي ميكرومتر سميكة 10 مع 0.4 ميكرومتر المسام. المسام يسمح بتبادل العوامل يفرزها، وتمنع في نفس الوقت، مما يشير إلى جوكستاكريني. ويمكن جمع الخلايا وتفكيك في نقطة النهاية تحديد الآثار المترتبة إشارات paracrine. بالإضافة إلى السماح للتدرجات تركيز مترجمة من العوامل يفرزها، هذا الأسلوب قابلة للتجارب التي تنطوي على فترات طويلة للثقافة، وكذلك استعمال مثبطات. بينما يمكننا استخدام هذا الأسلوب لدراسة التفاعلات بين الخلايا mesothelial التي يواجهونها في موقع خبيث وخلايا سرطان المبيض، يمكن تكييفها لأي خلية ملتصقة نوعين للباحثين لدراسة paracrine الإشارات في مختلف المجالات، بما في ذلك ورم المكروية وعلم المناعة، والتنمية.
Introduction
وقد أنشئ أيضا دور الإنتاجية التفاعلات المتبادلة بين الخلايا السرطانية وورم المكروية في تطور الورم وأصبحت محورا أساسيا للبحث في سرطان علم الأحياء1. حالات مماثلة للإشارات ثنائية الاتجاه حاسمة خلال الجرح تضميد الجراح، والاستجابات المناعية، والأوعية، ومنافذ الخلايا الجذعية، والتنمية2،،من34،،من56 , 7 , 8-هو سمة مشتركة في جميع هذه العمليات البيولوجية أن الخلايا تستجيب بطرق مختلفة إلى خارج الخلية العظة من بهم المكروية التي تحدد مصير الخلايا والأنسجة فسيولوجيا وتطور المرض. ولذلك تحولت التركيز متزايد نحو تطوير فهم أفضل للآليات التي تشارك في هذه الاتصالات خلية خلية. تشمل غالبية هذه التفاعلات باراكريني أو جوكستاكريني الإشارات بين الخلايا. إشارات Paracrine ينطوي على إفراز عوامل إشارات محددة بمقدار خلية واحدة حيث يعتبرها المستقبلات المقابلة في خلية أخرى في المنطقة المجاورة، مما آثار ردا في ذلك10من9،، في حين جوكستاكريني الإشارات يتطلب اتصال مباشر بين المكونات الخلوية من خليتين تشارك11،12.
هذه الإشارات عنصر حاسم في التوازن الأنسجة، وكذلك في ورم المكروية. الخلايا السرطانية الاستفادة من عوامل باراكريني وجوكستاكريني من الخلايا في ستروما الورم، بما في ذلك المرتبط بسرطان الخلايا الليفية (اجواءه) والخلايا المناعية adipocytes13،14،،من1516. باراكريني إشارات يمكن أن توسط عوامل النمو، السيتوكينات، المستقطبات، إلخ، بينما يشير جوكستاكريني ينطوي على يغاندس جنبا إلى جنب والمستقبلات كما هو الحال في الشق الإشارات، أو التفاعلات بين إينتيجرينس ومنها المصفوفة خارج الخلية البروتينات. لقد أظهرنا أهمية التفاعلات المتبادلة بين خلايا سرطان المبيض واجواءه في استئصال ورم خبيث وتطور14. وبالمثل، تنظيم التفاعلات بين خلايا سرطان المبيض metastasizing مع الخلايا mesothelial تغطي موقع خبيث ميكرورناس الرئيسية وعوامل النسخ في الخلايا السرطانية التي تروج للاستعمار المنتشر17، 18.
معظم الدراسات على إشارات paracrine تنطوي على استخدام وسيلة المكيفة التي تم جمعها من نوع خلية واحدة لعلاج نوع الخلية الثانية مع. بينما تم استخدام هذا النهج على نطاق واسع، فإنه لا نسخ فعالية مستويات عالية التركيز المترجمة عامل يفرز في المكروية الخلية المستقبلة. كما فشل استنساخ الحركية التدفق المستمر للعامل الذي يفرز يجري إنتاجها بمقدار خلية واحدة وتتلقاها الخلية المجاورة. باراكريني الإشارات هي فعالة عبر مسافات قصيرة كما العوامل التي يفرزها في التركيزات المطلوبة فقط محيط الخلية المصدر وتميل إلى منتشر وتضعف بزيادة المسافة. هذا التركيز العالي مترجمة يفرز عامل ضروري لتؤدي إلى استجابة في الخلية المستقبلة. وعلاوة على ذلك، أيضا استجابة الخلايا المتلقية تعتمد على التوازن بين العوامل يفرز حديثا وعلى استنزاف مستمر من خلال تدهور، وملزمة، واستيعاب في الخلايا المتلقية ونشرها بعيداً عن الخلية المصدر. يمكن أن تكون وسيطة مكيفة مركزة لحساب أعلى تركيزات المترجمة موجودة في المكروية، ولكن دقة لا يمكن النسخ المتماثل التركيزات الدقيقة. وعلاوة على ذلك، فإنه لا يمكن تقليد الحركية الطبيعية للإنتاج ونضوب عامل بالمشاركة. أكثر دقة تكرار الإشارات باراكريني وفصله من جوكستاكريني مما يشير إلى آليات، وضعنا أسلوب رواية ثقافة الدانية، الذي ينطوي على زراعة أنواع الخلايا اثنين على السطح أما لغشاء يسهل اختراقها. المسام صغيرة بما يكفي لمنع التفاعلات جوكستاكريني ويسمح بتبادل العوامل يفرز بتركيزات عالية مترجمة. وبهذه الطريقة، يحتفظ هذا النظام حركية الإنتاج ونضوب العوامل باراكريني.
Protocol
Representative Results
Discussion
فهم إليه باراكريني وجوكستاكريني الإشارات بين الخلايا أمر ضروري لتطوير معرفة أفضل بأنسجة طبيعية التوازن والمرض ظروف7،8. باراكريني معظم الإشارات وتجري دراسات عن طريق جمع مكيفة المتوسطة من نوع خلية واحدة واستخدامه لعلاج نوع الخلية الأخرى. يحتوي هذا الأسلوب م…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن مدينون للمرضى للمشاركة في جمع الأنسجة لهذه التجارب. “وزارة الدفاع أوكرب المبيض السرطان جائزة الأوسكار” (W81XWH-15-0253) وجائزة تجريبية من “مؤسسة حلم” كولين في إلى Anirban ك. ميترا يؤيد هذا البحث.
Materials
| 24 mm Transwell permeable support with 0.4 µm Pore Polycarbonate Membrane Insert | Corning (Costar) | 3412 | • 10 µm thick translucent polycarbonate membrane • Treated for optimal cell attachment • Packaged 6 inserts in a 6 well plate, 4 plates per case • Membrane must be stained for cell visibility • Sterilized by gamma radiation |
| 6 well plate | Corning (Falcon) | 353046 | Flat Bottom, TC-treated, sterile, with Lid |
| 15 cm culture dish | Corning (Falcon) | 353025 | Sterile, TC-treated Cell Culture Dish |
| DMEM | Corning (Cellgro) | 10-013-CV | |
| Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| MEM Nonessential amino acids | Corning (Cellgro) | 25-025-CI | |
| MEM Vitamins | Corning (Cellgro) | 25-020-CI | |
| 0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Pipets | Any make is fine | ||
| CO2 Incubator | Any make is fine | ||
| Biosafety level II cabinet | Any make is fine | ||
| FN1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs01549976_m1 | |
| TGFB1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs00998133_m1 | |
| CDH1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs01023895_m1 | |
| GAPDH TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs99999905_m1 | |
| miRNeasy mini RNA isolation Kit | Qiagen | 217004 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | 43-688-13 | |
| HeyA8 ovarian cancer cells | Obtained from Ernst Lengyel Lab, University of Chicago | ||
| TGFβ Neutralizing Antibody | R&D Systems | MAB1835-100 |
Referenzen
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Cupedo, T., Mebius, R. E. Cellular interactions in lymph node development. The Journal of Immunology. 174 (1), 21-25 (2005).
- Suvas, S. Role of Substance P Neuropeptide in Inflammation, Wound Healing, and Tissue Homeostasis. The Journal of Immunology. 199 (5), 1543-1552 (2017).
- Gnecchi, M., Danieli, P., Malpasso, G., Ciuffreda, M. C. Paracrine Mechanisms of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Repair. Methods in Molecular Biology. , 123-146 (2016).
- Lionetti, V., Bianchi, G., Recchia, F. A., Ventura, C. Control of autocrine and paracrine myocardial signals: an emerging therapeutic strategy in heart failure. Heart Failure Reviews. 15 (6), 531-542 (2010).
- Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model. International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).
- Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Tackling the cancer stem cells – what challenges do they pose. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (7), 497-512 (2014).
- Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells. Cell Stem Cell. 16 (3), 225-238 (2015).
- Elenbaas, B., Weinberg, R. A. Heterotypic signaling between epithelial tumor cells and fibroblasts in carcinoma formation. Experimental Cell Research. 264 (1), 169-184 (2001).
- Wilson, K. J., et al. EGFR ligands exhibit functional differences in models of paracrine and autocrine signaling. Growth Factors. 30 (2), 107-116 (2012).
- Kopan, R. Notch signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (10), (2012).
- Singh, A. B., Sugimoto, K., Harris, R. C. Juxtacrine activation of epidermal growth factor (EGF) receptor by membrane-anchored heparin-binding EGF-like growth factor protects epithelial cells from anoikis while maintaining an epithelial phenotype. Journal of Biological Chemistry. 282 (45), 32890-32901 (2007).
- Swartz, M. A., et al. Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy. Krebsforschung. 72 (10), 2473-2480 (2012).
- Mitra, A. K., et al. MicroRNAs reprogram normal fibroblasts into cancer-associated fibroblasts in ovarian cancer. Cancer Discovery. 2 (12), 1100-1108 (2012).
- Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nature Medicine. 17 (11), 1498-1503 (2011).
- Salimian Rizi, B., et al. Nitric oxide mediates metabolic coupling of omentum-derived adipose stroma to ovarian and endometrial cancer cells. Krebsforschung. 75 (2), 456-471 (2015).
- Mitra, A. K., et al. Microenvironment-induced downregulation of miR-193b drives ovarian cancer metastasis. Oncogene. 34 (48), 5923-5932 (2015).
- Tomar, S., et al. ETS1 induction by the microenvironment promotes ovarian cancer metastasis through focal adhesion kinase. Cancer Letters. 414, 190-204 (2018).
- Ovarian Cancer Metastasis: A Unique Mechanism of Dissemination. Tumor Metastasis Available from: https://www.intechopen.com/books/tumor-metastasis/ovarian-cancer-metastasis-a-unique-mechanism-of-dissemination (2016)
- Iwanicki, M. P., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discovery. 1 (2), 144-157 (2011).
- Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4614-4628 (2014).
- Boelens, M. C., et al. Exosome transfer from stromal to breast cancer cells regulates therapy resistance pathways. Cell. 159 (3), 499-513 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).
- Kohlhapp, F. J., Mitra, A. K., Lengyel, E., Peter, M. E. MicroRNAs as mediators and communicators between cancer cells and the tumor microenvironment. Oncogene. 34 (48), 5857-5868 (2015).
