Engineering-Transplantation geeignet retinalen Pigment Epithel Gewebe abgeleitet aus humanen embryonalen Stammzellen

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Methode um eine netzhautgewebe bestehend aus retinalen Pigment epithelialen Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen gezüchtet auf menschliche amniotic Membranen und deren Vorbereitung für die Verpflanzung in Tiermodellen zu konstruieren.

Zusammenfassung

Mehreren pathologische Zuständen des Auges beeinträchtigen die Funktionalität bzw. das Überleben des retinalen Pigmentepithels (RPE). Dazu gehören einige Formen der Retinitis Pigmentosa (RP) und Altersbedingte Makula-Degeneration (AMD). Zelltherapie ist eines der vielversprechendsten therapeutischen Strategien vorgeschlagen, diese Krankheiten bereits ermutigende Zwischenstand beim Menschen zu heilen. Die Methode der Zubereitung des Transplantats hat jedoch erhebliche Auswirkungen auf die funktionellen Ergebnisse in Vivo. RPE-Zellen als eine Zellsuspension gepfropft sind nämlich weniger funktional als die gleichen Zellen als eine netzhautgewebe transplantiert. Hier beschreiben wir eine einfache und reproduzierbare Methode, Ingenieur RPE Gewebe und deren Vorbereitung für eine Implantation in Vivo . RPE Zellen aus menschlichen pluripotente Stammzellen sind auf eine biologische Unterstützung, die menschlichen amniotic Membrane (Schinken) ausgesät. Im Vergleich zu künstlichen Gerüste, hat diese Unterstützung den Vorteil, dass eine Basalmembran, die in der Nähe der Bruch-Membran ist wo endogene RPE-Zellen verbunden sind. Jedoch seine Manipulation ist nicht einfach, und wir mehrere Strategien für seine ordnungsgemäße Kultivierung und Vorbereitung für die Verpflanzung in Vivoentwickelt.

Einleitung

RPE ist entscheidend für das Überleben und die Homöostase der Photorezeptoren mit denen sie eng verbunden¹ist. Verschiedene pathologische Zustände verändern seine Funktionalität und/oder überleben, darunter RP und AMD.

RP ist eine Gruppe von geerbten monogenen Mutationen, die die Funktionen der Photorezeptoren oder RPE-Zellen oder beide^2,3betreffen. Es wird geschätzt, dass Mutationen, die betreffen speziell die RPE Zellen machen 5 % der RP². AMD ist eine weitere Bedingung wo die RPE-Schicht verändert ist, führende letztlich zu zentrale....

Protokoll

Alle Menschen in diesem Protokoll verwendete Materialien wurden nach Verordnungen der Europäischen Union verwendet. Die menschliche ES-Zell-Linie, die in dieser Studie verwendeten stammt aus einem einzigartigen Embryo. Das Paar, das den Embryo gespendet hatte wurde umfassend informiert und gaben ihre Zustimmung für eine anonyme Spende. Eine klinische Grade menschliche ES Zelllinie wurde abgeleitet von diesem Embryo, überhöht, qualifiziert und ordnungsgemäß dokumentiert von Roslin Zellen (UK). Schinken wurden unter sterilen Bedingungen bei einem Kaiserschnitt bei Müttern beschafft, die eine informierte Einwilligung für Plazenta Spende nach krankenhausrichtlinien (APHP,....

Ergebnisse

Schinken enthalten eine Epithelschicht, die entfernt werden sollten, bevor die Aussaat von RPE-Zellen. Eine enzymatische Behandlung der Membran erfolgt mit dem Thermolysin unter schütteln. In der Reihenfolge nicht, nicht verlieren die Polarität der Membran (das Epithel ist auf einer Seite), es ist fixiert auf einem Träger, welche Zusammensetzung je nach Anbieter (Abbildung 1A) unterscheiden könnte. Überprüfen Sie die Adhäsion der Membran um seine Unterstützun.......

Diskussion

Wir beschrieb eine Methode für die Kultur der RPE-Zellen auf eine biologische Gerüst und deren Vorbereitung für die Implantation in Tiermodellen. Einer der kritischen Schritte des Protokolls ist die Wartung der Orientierung des Schinkens entlang des Verfahrens bis zu seiner Aufnahme in Gelatine. In der Tat, das native Epithel der Membran entfernt, und die Basalmembran wird ausgesetzt⁹. Die RPE-Zellen müssen auf diese Basalmembran ausgesät werden. Bei der Vorbereitung für die Einbettung von Gelatin.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Sterile Biosicherheitswerkbank	TechGen International	Nicht zutreffend
Entsorgungssystem für flüssige Abfälle für die Aspiration	Vacuubrand	BVC 21
CO2gesteuert +37  ° C-Zell-Inkubator	Thermo Electron Corporation	BVC 21 NT
200  &Mikro; L-Pipette: P200	Gilson	F144565
1  ml Pipette: P1000	Gilson	F144566
Pipettenhilfe	Drummond	75001
+4  ° C Kühlschrank	Liebherr	Nicht zutreffend
Vibratome	Leica	VT1000S
Feine Schere	WPI	501758
Pinzette (x2)	WPI	555227F
Wasserbad	Grant subaqua pro	SUB6
Präzisionswaage	Sartorius	CP225D
Zentrifuge	Eppendorff	5804
Mikroskop	Olympus	SC30
Horizontaler Schaukelschüttler	IKA-WERKE	IKA MTS 214D
Vortex	VWR	LAB DANCER S40
Einweg-Skalpell	WPI	500351
Kunststoff-Paraffinfolie	VWR	PM992
µ m Einmal-Spritzenvorsatzfilter	SARTORIUS	16532
Spritze ohne Nadel 50 mL	Dutscher	50012
Flaschen 250 mL	Dutscher	28024
15 mL steril Falcon Röhrchen	Dutscher	352097
50 mL steril Falcon Röhrchen	Dutscher	352098
Kultureinsatz	Scaffdex	C00001N
60  mm Zellkulturdaten: B6	Dutscher	353004
12-Well-Zellkulturplatte	Corning	3512
6-Well-Kulturplatten	Corning	3506
Rasierklingen	Ted Pella, Inc	121-9
Cyanacrylat-Kleber	Castorama	3178040670105
PBS 1x (500  mL)	Sigma	D8537
Thermolysin	Roche	5339880001
DMEM, hoher Glukosegehalt, GlutaMAX	Invitrogen	61965-026
KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS)	Invitrogen	12618-013
MEM-NEAA (100x)	Invitrogen	11140-035
b-Mercaptoethanol (50  mM)	Invitrogen	31350-010
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140122
CO2unabhängiges Medium	GIBCO	18045-054
Gelatine	MERCK	104078
menschliche Amnionmembran	Gewebebank St. Louis Krankenhaus (Paris, Frankreich)	Nicht zutreffend

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