Generation von Knock-out-Grund- und erweiterten menschlichen NK-Zellen mit Cas9 Ribonucleoproteins

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur primären oder erweiterten menschlichen natürlichen (NK) Killerzellen mit Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs) genetisch zu verändern. Mithilfe dieses Protokolls erzielten wir menschliche NK-Zellen für Umwandlung Wachstumsfaktor-b-Rezeptor 2 (TGFBR2) und Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) mangelhaft.

Zusammenfassung

CRISPR/Cas9 Technologie beschleunigt sich Genom-Technik in vielen Zelltypen, aber so weit gen Lieferung und stabile gentechnische Veränderung im primären NK-Zellen herausfordernd gewesen. Transgen-Lieferung mit Lentivirale oder retrovirale Transduktion führte beispielsweise in einer begrenzten Ausbeute von gentechnisch NK-Zellen durch erhebliche Verfahren verbundenen NK Zelle Apoptose. Wir beschreiben hier eine DNA-freie Methode für Genom-Bearbeitung von menschlichen Grund- und erweiterten NK-Zellen mit Cas9 Ribonucleoprotein komplexe (Cas9/RNPs). Diese Methode erlaubt effiziente ko von TGFBR2 und HPRT1 Gene in NK-Zellen. RT-PCR-Daten zeigten eine signifikante Abnahme der Gen-Expression-Ebene, und ein Zytotoxizität Assay eines repräsentativen Zelle Produkts vorgeschlagen, dass die RNP-modifizierte NK-Zellen weniger empfindlich auf TGFβ wurde. Genetisch veränderte Zellen möglicherweise erweiterte Post-Elektroporation durch Stimulation mit bestrahlten mbIL21 exprimierenden Feeder-Zellen.

Einleitung

Krebs-Immuntherapie wurde in den letzten Jahren vorgebracht worden. Genetisch veränderte chimeric Antigen-Rezeptor (Auto)-T-Zellen sind ein hervorragendes Beispiel von veränderter Immunzellen erfolgreich in Krebsimmuntherapie eingesetzt. Diese Zellen wurden vor kurzem genehmigt durch die FDA für die Behandlung gegen CD19 + B-Zell-Tumoren, aber Erfolg ist bisher beschränkt sich auf Krankheiten, die mit ein paar Aktionsleisten Antigene und targeting so begrenzten Antigen Repertoire ist anfällig für Fehler durch immun Flucht. Darüber hinaus haben Auto-T-Zellen auf die Verwendung von autologen T-Zellen wegen der Gefahr der Graft - Versus - Host-Seuche verursacht durch all....

Protokoll

Gesunden Spenders buffy Coats wurden als Quellenmaterial aus dem Central Ohio Region amerikanischen Roten Kreuz erhalten. Diese Forschung war entschlossen, ausgenommen Forschung werden durch die institutionelle Review Board der bundesweit Kinderkrankenhaus.

1. menschliche NK Zelle Reinigung und Ausbau

1. PBMCs von Buffy Coat¹²isolieren.
   1. 35 mL buffy Coat Probe auf 15 mL Ficoll-Paque Schicht.
   2. Zentrifugieren bei 400 X g für 20 Minuten ohne Bremse und sammeln die PBMC aus der Schnittstelle.
   3. Die wiederhergestellten PBMCs dreimal durch Zugabe von mindestens ein gleiches Volumen an PBS w....

Ergebnisse

Elektroporation Effizienz

Zur Optimierung der Elektroporation von Cas9/RNPs haben wir 16 verschiedene Programme mit Transduktion von GFP-targeting SiRNA und DNA Plasmid in NK-Zellen getestet. Flow Cytometry Test zeigte, dass die EN-138 den höchsten Anteil an Lebensfähigkeit und Transduktion Zelleffizienz (35 % lebenden GFP positive Zellen) für beide Teilchen (Abbildung 1 und

Diskussion

DNA-abhängige Änderung der NK-Zellen hat^4,9streitig gemacht. Wir, stellten daher direkt eine synthetisch vorgeformten Ribonucleoprotein (RNPs) Komplex und Cas9 Protein als gereinigtes Protein in Grund- und erweiterten NK Zellen⁸. Diese Methode erlaubte uns, Deckelung, zu beseitigen, Beschatten, und andere transkriptionelle und translationalen Prozesse gestartet durch RNA-Polymerase II, die NK Zelle Apoptose DNA-abhängige Signaltransduktion.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
RosetteSep&Handel; Menschlicher NK Zellanreicherungscocktail	STEMCELL Technologies	15065	Die RosetteSep™ Der Human NK Cell Enrichment Cocktail wurde entwickelt, um NK-Zellen durch Negativselektion aus Vollblut zu isolieren.
Ficoll-Paque® PLUS	GE Healthcare - Biowissenschaften	17-1440-02
Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA	Integrated DNA Technologies	1072532	TracrRNA, die proprietäre chemische Modifikationen enthält, die eine erhöhte Nukleaseresistenz verleihen. Hybridisiert zu crRNA, um das Cas9-Enzym
Alt-R® zu aktivieren CRISPR-Cas9 crRNA	Integrated DNA Technologies		Synthetisch hergestellt als Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, basierend auf der Sequenz der designten gRNA, die auf das Gen des Interesses abzielt
Alt-R® Genom-Editing-Detektionskit	Integrierte DNA-Technologien	1075931	Jedes Kit enthält T7EI-Endonuklease, T7EI-Reaktionspuffer und T7EI-Assay-Kontrollen.
Platin® Taq DNA Polymerase High Fidelity	Invitrogen	11304-011
4D-Nukleofector & Handel; System	Lonza	AAF-1002B
Humanes rekombinantes IL-2-Protein	Novartis	65483-0116-07
P3 Primärzelle 4D-Nukleofector™ X Kit		Lonza V4XP-3032	Enthält pmaxGFP™ Vektor, Nukleofector & Handel; Lösung, Ergänzung, 16-Well-Nukleocuvette&Handel; Strips
Non-Targeting: Custom siRNA, Standard 0,05 2mol ON-TARGETplus	Dharmacon	CTM-360019
Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLS	Integrated DNA Technologies	1074181	Cas9 Nuclease
DNeasy® Blut & Taschentuchhandbuch	Qiagen	69504
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
Calcein AM	ThermoFisher	C3099
TGFβ	Biolegend	580706
Alt-R® CRISPR-Cas9-Kontrollkit,	Integrated DNA Technologies	1072554	Enthält tracrRNA, HPRT-Positivkontroll-crRNA, Negativkontroll-crRNA#1, HPRT-Primer-Mix und nukleasefreien Duplex-Puffer.
IDTE pH 7,5 (1X TE Lösung)	Integrated DNA Technologies	11-01-02-02
Alt-R® Cas9 Elektroporationsverstärker	Integrierte DNA-Technologien	1075915	Cas9 Elektroporationsverstärker

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