Oberfläche-verstärkte Resonanz Raman-Streuung Nanoprobe Ratiometry zur Erkennung von mikroskopischen Eierstockkrebs über Folsäure Rezeptor Targeting

Summary

Eierstockkrebs bildet Metastasen in die Bauchhöhle. Hier präsentieren wir ein Protokoll machen und Verwendung Folat-Rezeptor gezielt Oberfläche verstärkte Resonanz Raman-Streuung Nanosonden, die diese Läsionen mit hoher Spezifität über ratiometrischen Bildgebung zu offenbaren. Die Nanosonden lebenden Mäusen intraperitoneal verabreicht werden, und die abgeleitete Bilder korreliert gut mit der Histologie.

Abstract

Eierstockkrebs ist die tödlichsten gynäkologische Malignom. Die meisten Patienten präsentieren sich in einem fortgeschrittenen Stadium (FIGO-Stadium III oder IV), wenn lokale Metastasen verbreiten bereits stattgefunden hat. Eierstock-Krebs hat ein einzigartiges Muster der Metastasierung, in diesem Tumor Implantate zunächst in der Bauchhöhle enthalten sind. Diese Funktion könnte im Prinzip die komplette Resektion des Tumors Implantate mit heilender Absicht. Viele dieser metastatischen Läsionen sind mikroskopisch, so dass sie schwer zu erkennen und zu behandeln. Neutralisierung solcher Fixierungsprotokoll gilt als ein wichtiges Ziel zur Beseitigung von Tumor-Rezidiv und langfristiges Überleben zu erreichen. Raman imaging mit Oberfläche verstärkte Resonanz Raman-Streuung Nanosonden kann verwendet werden, um mikroskopisch kleine Tumoren mit hoher Empfindlichkeit, durch ihre helle und Bioorthogonal spektrale Signaturen zu umreißen. Hier beschreiben wir die Synthese von zwei “Varianten” von solchen Nanosonden: ein Antikörper funktionalisiert derjenige, der die Folat-Rezeptor richtet sich an – in vielen Ovarialkarzinome überexprimiert — und eine ungezielte Steuerung Nanoprobe mit unterschiedlichen Spektren. Die Nanosonden sind gemeinsam verwalteten intraperitoneal, Maus-Modellen der metastatischen menschlichen Eierstock Adenokarzinom. Alle Tierversuche stimmten die institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss des Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Die Bauchhöhle der Tiere ist chirurgisch ausgesetzt, gewaschen und mit einem Raman Microphotospectrometer gescannt. Anschließend die Raman-Unterschriften von zwei Nanosonden sind entkoppelten mit einem klassischen Least Squares passenden Algorithmus, und ihre jeweiligen Noten aufgeteilt, um ein ratiometrischen Signal von Folat gezielt über ungezielte Sonden zu liefern. Auf diese Weise werden mikroskopische Metastasen mit hoher Spezifität visualisiert. Der größte Vorteil dieses Ansatzes ist, dass die lokale Anwendung in der Bauchhöhle – was kann bequem während des chirurgischen Eingriffs erfolgen – können tag Tumoren ohne systemische Nanopartikel Exposition des Patienten zu unterwerfen. Falsche Positive Signale aus unspezifischen Bindung der Nanosonden auf viszerale Oberflächen beseitigt werden kann, von einem ratiometrischen Ansatz folgend, wo gezielte und ungezielte Nanosonden mit unterschiedlichen Raman-Signaturen als Mischung angewandt. Das Verfahren ist derzeit noch begrenzt durch den Mangel an einer kommerziellen Weitfeld-Raman imaging Kamerasystem, wodurch einmal verfügbar für die Anwendung dieser Technik in den OP-Saal.

Introduction

Raman imaging mit “Oberfläche verstärkten Raman-Streuung” (SERS) Nanopartikel zeigte große Versprechung in Abgrenzung Läsionen in einer Vielzahl von Einstellungen und für viele verschiedene Tumor Typen^1,2,3,4 . Der Hauptvorteil von SERS Nanopartikeln ist ihr Fingerabdruck-ähnliche spektrale Signatur, bieten ihnen unzweifelhaft erkennen, die nicht durch biologische Hintergrund Signale⁵verwechselt wird. Darüber hinaus ist die Intensität des abgestrahlten Signals verstärkt mit dem Einsatz von Reporter Moleküle (Farbstoffe) mit Absorption Maxima im Einklang mit der Erregung Laser, verursachend “Oberfläche verstärkte Resonanz Raman-Streuung” (SERRS) Nanopartikel mit einer noch größeren Empfindlichkeit^{6,7,8,9,10,11,12}.

Eine Barriere, die für die Annahme von SE(R)RS Nanopartikel¹³ behandelt werden muss und viele andere Nanopartikel Konstrukte^14,15 für den klinischen Einsatz ist ihre Art der Verabreichung, als intravenöser Injektion systemische Ursachen Exposition des Agenten, und erfordert umfangreiche Tests, um mögliche Nebenwirkungen ausschließen. In diesem Artikel präsentieren wir ein anderes Paradigma, basierend auf der Anwendung von Nanopartikeln lokal in Vivo, direkt in der Bauchhöhle während der Operation, gefolgt von einen Waschschritt jede ungebundene Nanopartikel¹entfernen. Dieser Ansatz steht im Einklang mit neue therapeutische Ansätze, die derzeit untersucht werden, die auch von lokalen Instillation von Agenten in der Bauchhöhle, genannt hyperthermische intraperitoneale Chemotherapie (HIPEC) verwenden. So sollte das Prinzip selbst relativ einfach in einem klinischen Workflow zu integrieren. Wir haben die Bioverteilung der Nanopartikel nach intraperitonealer Anwendung untersucht, und nachweisbaren Absorption in den systemischen Kreislauf¹nicht eingehalten. Darüber hinaus umgeht die lokale Anwendung Ansatz die Sequestrierung von Nanopartikeln vom retikuloendothelialen System, so dass die Zahlen von Nanopartikeln erforderlich deutlich reduziert werden. Allerdings neigen bei topischer Anwendung, Antikörper-funktionalisiert Nanopartikel auf die viszerale Oberfläche auch in Abwesenheit von ihr Ziel einzuhalten. Um falsche positive Signale durch unspezifische Nanopartikel Haftung zu minimieren, verfolgen wir einen ratiometrischen Ansatz sieht eine Molekular gezielten Nanoprobe spezifisches Signal und eine ungezielte Steuerung Nanoprobe mit verschiedenen Raman-Spektrum, Konten für unspezifische Hintergrund^16,17. Wir haben diese Methode der topisch applizierten Oberflächen verstärkte Resonanz ratiometrischen Ramanspektroskopie vor kurzem in einem Mausmodell der diffusen Eierstockkrebs¹gezeigt.

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, zwei SERRS Nanosonden, eine gezielt zu entwickeln und eine unspezifische, lokal in Mausmodellen, angewendet werden, um die Prävalenz/Überexpression des Krebses Bild im Zusammenhang mit ratiometrischen Erkennung der beiden Sonden biomarker über Raman imaging. In dieser Arbeit wurde der Folat-Rezeptor (FR) als das Ziel gewählt, da dies ein Marker hochreguliert in viele Ovarialkarzinome^18,19. Raman Microimaging mit SERS-basierte Nanopartikel wurde ebenfalls für Krebs Zelle Identifikation²⁰nachgewiesen. Zwei unterschiedliche “Varianten” von Raman Nanopartikel sind, jeweils ein unterschiedlicher organischer Farbstoff seinen Fingerabdruck ableiten synthetisiert. Die Nanopartikel bestehen aus einem sternförmigen gold Kern von einer Silikon-Hülle umgeben und zeigen Oberflächenplasmonenresonanz auf rund 710 nm. Die Raman-Reporter (organischer Farbstoff) lagert sich gleichzeitig mit der Bildung von Kieselsäure Schale. Schließlich ist für die FR-gezielte Nanosonden (αFR-NPs) die Kieselsäure-Shell mit Antikörpern, konjugiert, während die ungezielte Nanosonden (nt-NPs) mit einer Monoschicht von Polyethylenglykol (PEG) passiviert werden.

Diese Technik wurde erfolgreich zur mikroskopische Tumoren in einem Mausmodell Xenograft der diffus metastasierten Ovarialkarzinom (SKOV-3), demonstriert seine Eignung für den Einsatz in-vivo Karte. Es kann auch für den Einsatz in ausgeschnittenen Gewebe für Tumor Phänotypisierung oder Marge Bestimmung nach Gallerte wie gezeigt in einer verwandten Studie²¹erweitert werden.

SERRS Nanosonden bieten eine robuste Plattform für die Erstellung von mehreren gezielten Tags für Biomarker, mit einfachen chemischen Reaktionen synthetisiert, wie in Abbildung 1schematisch dargestellt. Hier stellen wir das Protokoll für die Synthese der zwei Arten von SERRS Nanosonden (Abschnitte 1 bis 3), die Entwicklung einer geeigneten Eierstockkrebs-Maus-Modell (Abschnitt 4), die Verwaltung von Nanosonden und Bildgebung (Kapitel 5) und schließlich die Datenanalyse und Visualisierung (siehe Abschnitt 6).

Protocol

Alle Tierversuche wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss des Memorial Sloan Kettering Cancer Center (# 07.06.11) genehmigt. 1. gold Nanostar Kern Synthese Hinweis: Gold Nanostars dienen als Kerne für beide Varianten von SERRS Nanosonden in diesem Experiment verwendet. 800 mL 60 mM Ascorbinsäure (C6H8O6) Lösung in entionisiertem Wasser (DI) und 8 mL 20 mM Tetrachloroauric (HAuCl…

Representative Results

Zur Qualitätskontrolle kann die Nanopartikel charakterisiert werden, mit einer Vielzahl von Methoden bei der Synthese, einschließlich TEM, DLS, Nanopartikel Tracking Analyse und UV/Vis Absorption Spektroskopie, wie in Abbildung 2dargestellt. Auf diese Weise können die Größe des Kerns gold Nanostar (beschrieben in Abschnitt 1), die Bildung von Kieselsäure Schale (Abschnitt 2) und anschließende…

Discussion

Das hier beschriebene Protokoll bietet Unterricht für die Synthese von zwei “Varianten” von SERRS Nanosonden und ihre Beschäftigung bei Mäusen für Raman imaging ovarian Tumors überexprimierenden Folat-Rezeptor, mit einem ratiometrischen Algorithmus. Der wesentliche Vorteil der Raman imaging über andere optische bildgebenden Verfahren (z. B. Fluoreszenz) ist der hohen Spezifität der Nanoprobe Signal, das mit keine Signale biologischen Ursprungs verwechselt werden kann nicht. Bei dieser Ausführungsform der Raman im…

Materials

Name of Reagent
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A5960
3-MPTMS	Sigma-Aldrich	175617
Ammonium hydroxide (28%)	Sigma-Aldrich	338818
Anti-Folate Receptor antibody [LK26]	AbCam	ab3361
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	276855
Dimethyl sulfoxide (anhydrous)	Sigma-Aldrich	276855
Ethanol	Sigma-Aldrich	792780
IR140	Sigma-Aldrich	260932
IR780 perchlorate*	Sigma-Aldrich	576409	Discontinued*
Isopropanol	Sigma-Aldrich	650447
N.N.Dimethylformamide	Sigma-Aldrich	227056
PEG crosslinker	Sigma-Aldrich	757853
PEG-maleimide	Sigma-Aldrich	900339
Tetrachloroauric Acid	Sigma-Aldrich	244597
Tetraethyl Orthosilicate	Sigma-Aldrich	86578
*IR792	Sigma-Aldrich	425982	*Alternative
Name of Equipment
Dialysis cassette (3,500 MWCO)	ThermoFIsher	87724
Centrifugal filters	Millipore	UFC510096
inVia confocal Raman microscope	Renishaw
MATLAB (v2014b)	Mathworks
PLS Toolbox (v8.0)	Eigenvector research