여기, 우리는 프로토콜 기본 인간 피부 섬유 아 세포 MCPyV와 감염을 제시. 프로토콜은 제자리 교 잡에 피부 섬유 아 세포의 분리, MCPyV virions, 바이러스 감염, 면역 형광 염색 법, 형광의 준비를 포함 한다. 이 프로토콜은 MCPyV에 의해 특성화 MCPyV-호스트 상호 작용 및 다른 세포 유형 infectable을 발견에 대 한 확장할 수 있습니다.
메르켈 세포 감염 폴리오 (MCPyV)는 메르켈 세포 암 종 (MCC), 매우 공격적인 형태의 피부 암으로 이어질 수 있습니다. 기계 연구 MCPyV 분자 생물학 및 종양 메커니즘을 완벽 하 게 조사를 적절 한 셀 문화 모델의 부족에 의해 방해 되어 있다. 여기, 우리가 수행 하 고 기본 인간 피부 세포의 MCPyV 감염 검출을 위한 프로토콜의 집합을 설명 합니다. 프로토콜 immunofluorescent (IF) 얼룩이와 현장에서 DNA 교 잡 연쇄 반응 (HCR), 매우 민감한은 인간 피부 섬유 아 세포의 고립 재조합 MCPyV virions의 준비 및 바이러스 감염의 탐지 설명 제자리 교 잡 (물고기) 접근에서의 형광 본 프로토콜 관심이 연구원은 다른 세포 유형 또는 MCPyV 감염을 지 원하는 셀 라인을 식별 하 여 적응 될 수 있다. 설명된 물고기 접근 감지 감염 된 인간 피부에 바이러스 성 DNAs의 낮은 수준에 대 한 또한 적응 수 있습니다.
메르켈 세포 폴리오 (MCPyV)는 드물지만 적극적인 피부 암, 메르켈 세포 암 (MCC)1,2와 관련 된 작은, 이중 가닥 DNA 바이러스 이다. 고객 센터, 약 33%의 사망률의 흑색 종3,4를 초과합니다. MCPyV는1,~ 5 kb5 일찍 하 고 늦게 지역1코딩에 비 코딩 규제 지역 (NCRR)에 의해 bisected의 원형 게놈. NCRR 복제 (오 라), 바이러스 성 전사6,7에 대 한 양방향 발기인의 바이러스 성 기원을 포함 되어 있습니다. 초기 지역 대형 T (LT), 작은 T (sT), 57kT, 대체 LT ORF (알토), 뿐만 아니라 autoregulatory 미르1,8,,910라는 종양 항 원 단백질을 인코딩합니다. 늦은 지역 capsid 단백질 VP1, VP211,,1213인코딩합니다. LT와 세인트 베스트 공부 MCPyV 단백질은 바이러스 성 DNA 복제 및 MCPyV 유도 tumorigenesis5를 지원 하기 위해 표시 되었습니다. MCCs의 최대 80%에서 관찰 되었다, 주인 게놈으로 MCPyV DNA의 클론 통합 가능성이 바이러스 양성 종양 개발14,15에 대 한 원인 요소입니다.
고객 센터의 발생률은16지난 20 년 동안 3 배. 무 증상 MCPyV 감염 또한 일반 인구17,,1819에 대폭적 이다. 고객 센터 진단의 증가 수 및 MCPyV 감염의 높은 보급, 바이러스 그리고 종양 잠재력의 우리의 이해를 향상 시킬 필요가 있다. 그러나, MCPyV 생물학 및 종양 메커니즘의 여러 측면에 불완전 하 게 이해20남아 있다. 이것은 MCPyV 설립된 셀 라인11,12,21,,2223 에 가난 하 게 복제 하 고, 최근까지, 피부 세포 MCPyV를 지원 하기 때문에 크게 감염 된22되지 않았습니다 했다. 완전히 MCPyV 및 호스트 세포와의 상호 작용을 조사 하기 위해 기계 연구 전파 바이러스5셀 문화 시스템의 부족에 의해 방해 되어 있다.
우리는 기본 인간 피부 섬유 아 세포 (HDFs) 신생아 인간의 포 지원 강력한 MCPyV 감염에서 모두 고립 생체 외에서 발견 및 비보 전24. 이 연구에서 우리는 MCPyV24에 대 한 첫 번째 셀 문화 감염 모델 설립. 이 모델 시스템을 기반으로, 우리는 매트릭스 metalloproteinase (MMP) 유전자는 WNT/β-catenin 신호 통로 및 다른 성장 인자에 의해 유도 MCPyV 감염 자극 보였다. 또한, 우리는 FDA 승인 MEK 적 trametinib MCPyV 감염5,25을 효과적으로 억제 한다 발견. 이 연구에서 우리 또한 설립 인간 피부 섬유 아 세포24,25, 격리 하기 위한 프로토콜 집합 MCPyV virions11,12, MCPyV 감염 인간 피부 섬유 아 세포에 수행 준비 24 , 25 그리고 경우 얼룩26에 의해 감지 MCPyV 단백질. 또한, 우리는 원래의 DNA 교 잡 연쇄 반응 (HCR) 기술27 감염 된 인간 피부 세포에서 MCPyV DNA를 탐지 하기 위한 매우 중요 한 물고기 기술을 (HCR DNA 물고기)를 개발 하기 위해 적응. 이러한 새로운 방법을 MCPyV MCPyV 감염에 세포질 응답의 감염 주기를 공부 하는 데 유용 있을 것입니다. MCPyV 감염을 유지 하는 자연 호스트 저수지 셀 셀을 MCC 종양을 알 수 없는 남아 있습니다. 우리이 원고에서 설명 하는 기술은 다양 한 종류의 인간의 세포 저수지 셀을 식별 하 고 고객 센터 종양의 기원 검사에 적용할 수 있습니다. 우리의 설립된 방법, HCR DNA 생선, 다른 DNA 종양 바이러스의 검출에 호스트 세포 상호 작용의 특성 또한 채택 수 있습니다.
인간의 피부 조직에서 피부 섬유 아 세포의 분리, 재조합 MCPyV virions의 준비, 배양된 세포, immunofluorescent 얼룩이 지 고 HCR 기술에서 적응 하는 민감한 물고기 방법의 감염을 포함 하 여, 위에서 설명한 방법입니다 MCPyV 감염27를 분석 하는 연구원을 사용 해야 합니다. 생체 외에서 MCPyV 감염을 달성 하는 가장 중요 한 단계 중 하나는 높은 titer virion 준비의 생산 이다. 여기에 설명 된 ?…
The authors have nothing to disclose.
저자 박사 Meenhard Herlyn (Wistar 연구소)과 박사 M. 셀 레스트 사이먼 (펜실베니아 대학교) 시 약 및 기술 지원 제공 감사 하 고 싶습니다. 우리는 또한 유용한 토론에 대 한 우리의 실험실의 구성원 감사. 이 작품은 국립 보건원 (NIH) 보조금 (R01CA187718, R01CA148768 및 R01CA142723), NCI 암 센터 지원 그랜트 (NCI P30 CA016520), 그리고 펜 CFAR 수상 (P30 AI 045008)에 의해 지원 되었다.
Fetal calf serum | HyClone | SH30071.03 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
GLUTAMAX I, 100X | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-Glutamine |
DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | |
DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
Recombinant Human EGF Protein, CF | R&D systems | 236-EG-200 | Store at -80 degree celsius |
CHIR99021 | Cayman Chemical | 13122 | Store at -80 degree celsius |
CHIR99021 | Sigma | SML1046 | Store at -80 degree celsius |
Collagenase type IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
Dispase II | Roche | 4942078001 | |
Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240-062 | Protect from light |
DMEM medium | Thermo Fisher Scientific | 11965084 | |
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A11032 | Protect from light |
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Protect from light |
OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | Protect from light |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
anti-MCPyV LT (CM2B4) | Santa Cruz | sc-136172 | Lot # B2717 |
MCV VP1 rabbit | Rabbit polyclonal serum #10965 | https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm | |
Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant | Corning | 354060 | Store at -80 degree celsius |
Benzonase Nuclease | Sigma | E8263 | |
Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase | EPICENTRE | E3101K | |
Probe hybridization buffer | Molecular technologies | ||
Probe wash buffer | Molecular technologies | ||
Amplification buffer | Molecular technologies | ||
Alexa 594-labeled hairpins | Molecular technologies | B4 | Protect from light |
Triton X-100 | Sigma | X100 | |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | Thermo Fisher Scientific | P7581 | |
BamHI-HF | NEB | R3136 | |
Buffer PB | Qiagen | 19066 | |
blue miniprep spin column | Qiagen | 27104 | |
50mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | |
T4 ligase | NEB | M0202T | |
MagicMark XP | Thermo Fisher Scientific | LC5602 |