CRISPR-Cas ist eine leistungsstarke Technologie, die komplexe Genome von Pflanzen und Tieren zu entwickeln. Hier zeigen wir ein Protokoll, das menschliche Genom mit verschiedenen Cas jedoch effizient zu bearbeiten. Wir markieren wichtige Überlegungen und Design-Parameter zur Optimierung der Bearbeitung Effizienz.
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Methodenartikel
Genom-Bearbeitung in Säugetieren Zelllinien mit CRISPR-Cas
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die gruppierten regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR) System funktioniert natürlich in bakteriellen adaptive Immunität, sondern hat erfolgreich für Genom-Engineering in vielen verschiedenen Lebewesen zweckentfremdet worden. In den meisten Fällen der Wildtyp CRISPR verbundenen 9 (Cas9) oder Cas12a Endonuklease wird verwendet, um bestimmte Stellen im Genom, Spalten, nach denen die DNA-Doppelstrang-Pause über die nicht-homologe Ende verbinden (NHEJ) Weg oder die Reparatur unter der Regie von Homologie (repariert wird HDR) Weg, je nachdem, ob eine Spender Vorlage abwesend oder bzw. zu präsentieren. Bisher wurden die CRISPR-Systeme von verschiedenen Bakterienarten durchführen, Genom-Bearbeitung in Säugetierzellen werden gezeigt. Jedoch trotz der scheinbaren Einfachheit der Technik mehrere Design-Parameter berücksichtigt werden müssen, die oft Benutzer verwirrt darüber, wie am besten ihr Genom Bearbeitung Experimente durchführen lassen. Hier beschreiben wir einen kompletten Workflow von Versuchsanordnung zur Identifikation von Zellklonen, die gewünschte DNA-Modifikationen, mit dem Ziel der Erleichterung der erfolgreichen Ausführung des Genoms Bearbeitung Experimente in Säugetieren Zelllinien zu tragen. Wir markieren wichtige Überlegungen für die Nutzer zu beachten, einschließlich der Auswahl der CRISPR-System, die Abstandhalter Länge und das Design eine einzelsträngige Oligodeoxynucleotide (SsODN)-Spender-Vorlage. Wir uns vorstellen, dass dieses Workflows nützlich für gen Knockout Studien, Modellierung Bemühungen, Krankheit oder die Generation der Reporter Zellinien.
Einleitung
Die Fähigkeit, das Genom jeder lebende Organismus Ingenieur hat viele biomedizinische und biotechnologische Anwendungen, wie die Korrektur von krankheitserregenden Mutationen, Bau der korrekte Zellmodellen für Krankheit Studien oder Erzeugung von landwirtschaftlichen Pflanzen mit gewünschten Eigenschaften. Seit der Wende des Jahrhunderts, verschiedene Technologien wurden entwickelt für Genom-Engineering in Säugerzellen, einschließlich Meganucleases1,2,3, Zink-Finger Nukleasen4,5, oder Transkription-Aktivator-ähnliche ....
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Protokoll
1. Aufbau des sgRNAs
- Wählen Sie ein geeignetes CRISPR-Cas-System.
- Erstens prüfen der Zielregion für die PAM-Sequenzen von allen Cas9 und Cas12a Nukleasen, die nachweislich in Säugerzellen16,21-32funktionsfähig sein. Fünf häufigsten verwendeten Enzyme sind in Tabelle 1 zusammen mit ihren jeweiligen PAMs aufgeführt.
Hinweis: Neben den Endonucleases in Tabelle 1aufgeführt, es gibt andere weniger häufig verwendete Cas-Enzyme, die erfolgreich in Säugetierzellen ebenso, wie ein Cas9-Nuklease aus Streptococcus Thermophilus (St1Cas9) bereitgestellt wurden, die PAM NNAGAAW erkennt. Enthält die gewünscht....
- Erstens prüfen der Zielregion für die PAM-Sequenzen von allen Cas9 und Cas12a Nukleasen, die nachweislich in Säugerzellen16,21-32funktionsfähig sein. Fünf häufigsten verwendeten Enzyme sind in Tabelle 1 zusammen mit ihren jeweiligen PAMs aufgeführt.
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Ergebnisse
Durchführen ein Genoms Bearbeitung Experiment, ein CRISPR-Plasmid mit dem Ausdruck eine SgRNA Ausrichtung braucht die Locus-of-Interest geklont werden. Erstens ist das Plasmid mit einem Restriktionsenzym (in der Regel eine Art IIs Enzym) um es zu linearisieren verdaut. Es wird empfohlen, das verdaute Produkt auf einem 1 % Agarose-Gel neben einem unverdauten Plasmid zu unterscheiden, eine komplette und partielle Verdauung zu lösen. Da unverdaute Plasmide supercoiled sind, neigen sie, schneller als ihre Gegenstücke lineari.......
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Diskussion
Das CRISPR-Cas-System ist eine leistungsstarke, revolutionäre Technologie, die Genome und Transkriptom von Pflanzen und Tieren zu entwickeln. CRISPR-Cas-Systeme enthalten, die möglicherweise für Genom und technische Zwecke44Transkriptom angepasst wurden zahlreiche Bakterienarten gefunden. Obwohl die Cas9 Endonuklease von Streptococcus Pyogenes (SpCas9) war das erste Enzym erfolgreich in menschlichen Zellen21,22,
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Danksagungen
M.HS wird unterstützt von einer Agentur für Wissenschaft, Technologie und Forschung gemeinsame Ratsbüro Grant (1431AFG103), ein National Medical Research Council zu gewähren (OFIRG/0017/2016), National Research Foundation gewährt (NRF2013-THE001-046 und NRF2013-THE001-093), eine Ministerium der Ausbildung Stufe 1 Grant (RG50/17 (S)), ein Start-up gewähren von Nanyang Technological University, und die Mittel für die International genetisch Engineering Machine (iGEM) Wettbewerb der Nanyang Technological University.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| T4 Polynukleotidkinase (PNK) | NEB | M0201 | |
| Garnelen Alkaline Phosphatase (rSAP) | NEB | M0371 | |
| Tris-Acetat-EDTA (TAE) Puffer, 50X | 1. Base | BUF-3000-50X4L | Vor Gebrauch auf 1X verdünnen. Die 1X-Lösung enthält 40 mM Tris, 20 mM Essigsäure und 1 mM EDTA. |
| Tris-EDTA (TE) Puffer, 10X | 1. Base | BUF-3020-10X4L | Vor Gebrauch auf 1X verdünnen. Die 1X-Lösung enthält 10 mM Tris (pH 8,0) und 1 mM EDTA. |
| BbsI | NEB | R0539 | |
| BsmBI | NEB | R0580 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202 | 400.000 Einheiten/ml |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200 | Eine Alternative zu T4 DNA Ligase. |
| Rapid DNA Ligation Kit | Thermo Scientific | K1423 | Eine Alternative zu T4-DNA-Ligase. |
| Zero Blunt TOPO PCR Klonierungskit | Thermo Scientific | 451245 | Die Salzlösung wird mit dem TOPO-Vektor im Kit geliefert. |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | NEB | E2621L | Kit für Gibson Montage. |
| One Shot Stbl3 Chemisch kompetente E.Coli | Thermo Scientific | C737303 | |
| LB Bouillon (Lennox), Pulver | Sigma Aldrich | L3022 | Rekonstituieren in ddH20 und Autoklav vor Gebrauch |
| LB Bouillon mit Agar (Lennox), Pulver | Sigma Aldrich | L2897 | Rekonstituieren in ddH20 und Autoklav vor der Verwendung |
| SOC-Medien | - | 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM Glukose in 1 l LB Bouillon | |
| Ampicillin (Natrium), USP Grade | Gold Biotechnologie | A-301 | |
| REDiant 2X PCR Mastermix | 1. Base | BIO-5185 | |
| Agarose | 1. Base | BIO-1000 | |
| T7 Endonuklease I | NEB | M0302 | |
| Plasmid DNA Extraktion Miniprep Kit | Favorgen | FAPDE 300 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), | Hyklon | SH30081,01 | 4,5 g/l Glukose, kein L-Glutamin, HEPES und Natriumpyruvat |
| L-Glutamin, 200 mM | Gibco | 25030 | |
| Penicillin-Streptomycin, 10.000 U/ml | Gibco | 15140 | |
| 0,25 % Trypsin-EDTA, 1X | Gibco | 25200 | |
| fötales Rind Serum | Hyclone | SV30160 | FBS wird vor der Verwendung bei 56 oC für 30 min |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 1X | Gibco | 20012 | |
| jetPRIME Transfektionsreagenz | Polyplus Transfection | 114-75 | |
| QuickExtract DNA-Extraktionslösung, 1,0 | Epizentrum | LUCG-QE09050 | |
| ISOLATE II Genomic DNA Kit | Bioline | BIO-52067 | Eine Alternative zu QuickExtract |
| Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase | NEB | M0491 | |
| Desoxynukleotid (dNTP) Solution | NEB | N0447 | |
| 6X DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | 10 mM Tris-HCl (pH 7,6) 0,03 % Bromphenolblau, 0,03 % Xylolcyanol FF, 60 % Glycerin, 60 mM EDTA |
| Proteaseinhibitor Cocktail, Set3 | Merck | ||
| Nitrozellulosemembran, 0,2&Mikro; m | Bio-Rad | 1620112 | |
| Tris-Glycin-SDS-Puffer, 10X | Bio-Rad | 1610772 | Vor Gebrauch auf 1X verdünnen. Die 1x-Lösung enthält 25 mM Tris, 192 mM Glycin und 0,1% SDS. |
| Tris-Glycin-Puffer, 10X | 1. Base | BUF-2020 | Vor Gebrauch auf 1X verdünnen. Die 1x-Lösung enthält 25 mM Tris und 192 mM Glycin. |
| Ponceau S Lösung | Sigma Aldrich | P7170 | |
| TBS, 20X | 1. Basis | BUF-3030 | Vor Gebrauch auf 1X verdünnen. Die 1x Lösung enthält 25 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 150 mM NaCl. |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Magermilch für Immunoassay | Nacalai Tesque | 31149-75 | |
| WesternBright Sirius-Femtogramm HRP | Advansta | K12043 | |
| Antikörper für β-Aktin (C4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | Chargennummer: C0916 |
| MiSeq-System | Illumina | SY-410-1003 | |
| NanoDrop Spektralphotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Scientific | Q33226 | |
| EVOS FL Cell Imaging System | Thermo Scientific | AMF4300 | |
| CRISPR-Plasmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) | Addgen | 48138 | Einzelvektorsystem: Die gRNA wird aus demselben Plasmid exprimiert. |
| CRISPR-Plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA | Addgene | 61591 | Einzelvektorsystem: Die gRNA wird aus demselben Plasmid exprimiert. |
| CRISPR-Plasmid: xCas9 3.7 | Addgene | 108379 | Duales Vektorsystem: Die gRNA wird aus einem anderen Plasmid exprimiert. |
| CRISPR-Plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 | Addgene | 42230 | Einzelvektorsystem: Die gRNA wird aus demselben Plasmid exprimiert. |
| CRISPR-Plasmid: hCas9 | Addgen | 41815 | Duales Vektorsystem: Die gRNA wird aus einem anderen Plasmid exprimiert. |
| CRISPR-Plasmid: eSpCas9(1.1) | Addgen | 71814 | Einzelvektorsystem: Die gRNA wird aus demselben Plasmid exprimiert. |
| CRISPR-Plasmid: VP12 (SpCas9-HF1) | Addgen | 72247 | Duales Vektorsystem: Die gRNA wird aus einem anderen Plasmid exprimiert. |
Referenzen
- Epinat, J. C., et al. A novel engineered meganuclease induces homologous recombination in yeast and mammalian cells. Nucleic Acids Research. 31 (11), 2952-2962 (2003).
- Arnould, S., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
