Doppelsträngige RNA produziert während der RNA-Virus-Replikation man Muster Anerkennung Rezeptoren erkennt an eine angeborene Immunantwort zu induzieren. Für negativ-Sense-RNA-Viren bleibt die Interaktion zwischen dem Low-Level-DsRNA und PRRs unklar. Wir haben eine Methode konfokalen Mikroskopie Arenavirus DsRNA und PRR in einzelnen Zellen visualisieren entwickelt.
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Methodenartikel
Konfokale Abbildung von Double-Stranded RNA und Muster Anerkennung Rezeptoren im negativen Sinn-RNA-Virusinfektion
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Double-Stranded (ds) RNA wird als replikative Intermediate während RNA-Virus-Infektion hergestellt. Anerkennung von DsRNA von Host-Muster-Anerkennung-Rezeptoren (PRRs) wie die Retinsäure (RIG-ich) wie Rezeptoren (RLRs) RIG-I und Melanom Differenzierung-assoziierten Protein 5 (MDA-5) führt zur Induktion der angeborenen Immunantwort. Die Bildung und intrazelluläre Verteilung von DsRNA in positiv-Sense RNA-Virus-Infektion wurden gut charakterisiert, durch Mikroskopie. Viele negativ-Sense-RNA-Viren, einschließlich einige Arenaviruses auslöst der angeborenen Immunantwort, während Infektion. Negativ-Sense-RNA-Viren galten jedoch geringe Mengen an DsRNA, zu produzieren, die die bildgebende Untersuchung der PRR Anerkennung der viralen DsRNA behindert. Darüber hinaus müssen Infektions-Experimente mit hoch pathogenen Arenaviruses in high Containment Biosafety Level Einrichtungen (BSL-4) durchgeführt werden. Die Interaktion zwischen viralen RNA und PRRs für hoch pathogenen Virus RNA ist weitgehend unbekannt, aufgrund der zusätzlichen technischen Herausforderungen, die Forscher in den BSL-4-Anlagen stellen müssen. Vor kurzem fand ein monoklonaler Antikörper (Mab) (Klon 9 5) ursprünglich für Pan-Enterovirus-Erkennung verwendet speziell DsRNA mit eine höhere Empfindlichkeit als die traditionellen J2 oder K1 Anti-DsRNA Antikörper erkennen. Hierin, durch die Verwendung der 9 5 Antikörper, beschreiben wir ein konfokalen Mikroskopie-Protokoll, das erfolgreich verwendet wurde, um DsRNA, virale Proteine und PRR gleichzeitig in einzelnen Zellen infiziert durch Arenavirus visualisieren. Das Protokoll eignet sich auch für die bildgebenden Verfahren der DsRNA und PRR Verteilung in pathogenen Arenavirus infizierte Zellen in BSL4 Einrichtungen.
Einleitung
Der erste Schritt der Induktion der angeborenen Immunantwort ist Host Anerkennung der Doppelstrang-RNA (ds) durch die Muster-Anerkennung-Rezeptoren (PRRs) wie die Retinsäure (RIG-ich) wie Rezeptoren (RLRs) RIG-I und Melanom Differenzierung verbunden Eiweiß 5 (MDA-5)1. Für positiv-Sense-RNA-Viren DsRNA in der Regel leicht zu erkennen mit dem J2 oder K1 Anti-DsRNA monoklonaler Antikörper (Mab)2. Interaktion zwischen DsRNA und PRRs in positiv-Strang-RNA-Viren, wie z. B. Picornavirus, wurde mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie3gekennzeichnet. Jedoch für negativ-Sense RNA-Virus, hat Visualisierung und ....
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Protokoll
1. Vorbereitung von A549 Zellen und JUNV Infektion
- Samen 2 x 105 menschlichen Lunge A549 Epithelzellen auf Poly-D-Lysin (PDL) beschichtet Glasdeckgläser in 12-Well Platten bei 24 Stunden vor der Infektion.
- Bereiten Sie Aliquote von 150 mL JUNV13 bei einer Vervielfachung der Infektion (MOI) von 1,0 Plaque bilden Einheit pro Zelle verdünnt in Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) Medien ergänzt mit 2 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin und Streptomycin (P/S ).
- Entfernen Sie Medien aus Zellkultur. Fügen Sie Virus Inokulum auf jeder gut mit Deckglas und 1,5 h bei 37 ° c inkubieren Schütteln Sie ....
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Ergebnisse
Dieses Protokoll wurde angewandt, um die Verteilung und Kolokalisierung zwischen den RLRs zu studieren (RIG-I und MDA-5) und DsRNA in JUNV-infizierten Zellen. Wie in Abbildung 1 und Abbildung 2gezeigt, erhöht die Anhäufung von DsRNA im Laufe der Zeit als virale Infektion fortschreitet. Konzentriert, MDA-5 (Abbildung 1) und RIG-I (Abbildung 2) Signale wurden mit der punkt.......
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Diskussion
Für positiv-Sense-RNA-Viren und Viren DsDNA wird DsRNA leicht mit dem weit verbreiteten J2 Anti-DsRNA Antikörper erkannt. Allerdings sind negativ-Sense-RNA-Viren vermutlich DsRNA auf einem niedrigen oder unter die Nachweisgrenze mit dem gleichen Antikörper2zu produzieren. So sind viele Aspekte der viralen RNA und PRR Interaktion für negativ-Sense-RNA-Viren weitgehend unklar. Wir färben für DsRNA Arenavirus Infektion mit der J2-Antikörper versucht aber die Fluoreszenz-Signale wurden nicht differenz.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Wir möchten den UTMB imaging Core Einrichtungen und Maxim Ivannikov für Mikroskop Unterstützung bedanken.
Diese Arbeit wurde unterstützt von Public Health Service gewähren, RO1AI093445 und RO1AI129198 ausgezeichnet zu SP, UTMB Engagement Fonds P84373, CH und T32 AI007526 em.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| APEX Alexa Fluor 647 Antikörpermarkierungskit | Invitrogen | A10475 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| DAPI | Cell Signaling | 4083 | 1:1.000 Verdünnung |
| Esel-Anti-Kaninchen Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-11058 | 1:2.000 Verdünnung; Los #: 1454437 |
| Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium | Corning | 10-013-CV | |
| Fötales Rinderserum | Atlanta Bio | S11150 | |
| Glas-Objektträger | Fisher | 12-550-15 | |
| Ziegen-Anti-Maus Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | 1:2000 Verdünnung; Los #: 1874804 |
| Menschliche Lungenepithelzellen A549 ATCC | CCL-185 | ||
| Methanol | Fisher | A412 | Gelagert bei -20 &Grad; C |
| Maus MAb anti-JUNV NP | BEI | NA05-AG12 | Konjugiert mit Alexa-647 in 1:1.000 Verdünnung |
| Maus MAb pan-Enterovirus 9D5 Reagenz | Millipore Sigma | 3361 | gebrauchsfertig; verdünnt auf 1:2; Los #: 3067445 |
| PBS ergänzt mit Ca und Mg | Corning | 21-030-CV | |
| PDL beschichtete Deckgläser | Neuvitro | H-12-1,5-pdl | |
| ProLong Gold Antifading | Invitrogen | P10144 | |
| Kaninchen MAb MDA-5 | Abcam | ab126630 | 1:250 Verdünnung; Los #: GR97758-7 |
| recombiant Candid#1 Stamm von JUNV | Lab generated | Lab generated | Wie zuvor in Referenz 13 beschrieben. |
| RIG-I Maus MAb konjugiert mit Alexa-594 | Santa Cruz | sc-376845 | 1:1000 Verdünnung; Los #: AO218 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |
Referenzen
- Jensen, S., Thomsen, A. R. Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion. Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).
- Weber, F., Wagner, V., Rasmussen, S. B., Hartmann, R., Paludan, S. R.
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Nachdrucke und Genehmigungen
