Isolation und Adoptiveltern Übertragung von hohen Salz behandelt Antigen-präsentierende dendritische Zellen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur dendritische Zellen aus murinen Milz von magnetischen Zellsortierung und späteren Adoptiveltern Übertragung ins naive Mäuse zu isolieren. Das Modell von hohem Salzgehalt aktivierten dendritischen Zellen wurde gewählt, um die schrittweisen Verfahren Adoptiv-Transfer und Durchflusszytometrie zu erklären.

Zusammenfassung

Überschüssiges Salz Nahrungsaufnahme trägt zur Entzündung und spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von Bluthochdruck. Zuvor fanden wir, dass Antigen-präsentierende dendritische Zellen (DCs) spürt erhöhte extrazelluläre Natrium führt die Aktivierung von der NADPH-Oxidase und Bildung von Isolevuglandin (IsoLG)-Protein-Addukte. Diese IsoLG-Protein Addukte mit selbst-Proteine reagieren und fördern eine Autoimmun-artigen Zustand und Bluthochdruck. Wir haben entwickelt und optimiert, State-of-the-Art Methoden, um DC Funktion bei Hypertonie zu untersuchen. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zur Isolierung Vitro Behandlung mit erhöhten Natrium- und Adoptiveltern Übertragung der murinen Milz CD11c⁺ Zellen in Empfänger Mäuse, ihre Rolle bei der Hypertonie zu studieren.

Einleitung

Überschüssige diätetische Salz ist ein wichtiger Risikofaktor für Bluthochdruck. ^{1 , 2} the American Heart Association empfiehlt maximal 2.300 Milligramm (mg) Natrium (Na⁺)-Zufuhr pro Tag, jedoch; weniger als 10 % der US-Bevölkerung beobachtet diese Empfehlung. ^{3 , 4} bescheidene Reduzierung der Na⁺ Einnahme Blutdruck senken und die jährliche neue Fälle von koronarer Herzkrankheit und Schlaganfall in den USA um 20 % reduzieren. ⁵ ist ein großes Problem mit überschüssiger Salzverbrauch, dass 50 % der Bevölkeru....

Protokoll

Vanderbilt University institutionelle Animal Care und Use Committee haben die hier beschriebenen Verfahren zugestimmt. Mäuse sind untergebracht und betreut gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (National Academies Press. Überarbeitete 2010).

1. Isolierung der Milz von Mäusen

1. Bereiten Sie RPMI 1640: 10 % FBS, 0,10 mM HEPES, 1 mM Natrium Pyruvat, 50 µM β-Mercaptoethanol und 1 % Penicillin/Streptomycin.
2. 10 – 12 Wochen einschläfern-alte C57bl/6 männliche Mäuse durch CO₂ einatmen. Sprühen Sie die Brust und an den Seiten der Maus mit 70 % Ethanol. Öffnen Sie auf der linken Seite vorsichti....

Ergebnisse

Abbildung 1 stellt eine schematische Darstellung der oben beschriebenen Schritte. Isolierte murinen Milz sind für CD11c sortiert⁺ DCs durch magnetische Zelle sortieren und vergoldet in entweder normales Salz (NS; 150 Mmol NaCl) oder hohen Salz Medien (HS; 190 Mmol NaCl) für 48 h CD11c⁺ DCs werden dann mit einem Retro-Orbital adoptively übertragen Injektion zu naive Empfänger Mäuse. Zehn Tage später, werden Mäuse mit osmotischen Minipumps.......

Diskussion

In das aktuelle Protokoll haben wir Verfahren zur Isolierung von CD11c optimiert⁺ DCs aus der Milz von Mäusen und adoptively in naiven Tiere zur Untersuchung der Rolle von DCs in Salz-induzierte Hypertonie überführen. Dieses Protokoll kann angepasst zu isolieren und andere Immunzellen Teilmengen einschließlich adaptive Immunzellen einschließlich T- und B-Lymphozyten, Makrophagen und Monozyten adoptively übertragen werden. Wir haben die Milz Verdauungsprozess zur Erreichung angemessener Zelle überleben und Stab.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
APC/Cy7 Anti-Maus CD11c	Biolegend	117324
autoMACS Running Buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
CD11c Mikroperlen ultrarein	Miltenyi Biotec	130-108-338
Kollagenase D	Roche	11088866001
DNase I	Roche	10104159001
DPBS ohne Calcium und Magnesium	Corning	21-031-CV
FcR Blockierungsreagenz	Miltenyi Biotec	130-092-575
FITC Anti-Maus CD45	Biolegend	103108
GentleMACS C-Röhre	Miltenyi Biotec	130-096-334
GentleMACS Dissoziatorgerät	Miltenyi Biotec	130-093-235	Verwendungsprotokoll: Milz 04.01
LIVE/DEAD fixierbares violettes Färbeset für tote Zellen	Invitrogen	L34964
LS Säulen	Miltenyi Biotec	130-042-401
QuadroMACs Trenner	Miltenyi Biotec	130-090-976
RPMI 1640 mittel...	Gibco	11835-030