Induktion der medikamenteninduzierten Autoimmunhepatitis bei BALB/c-Mäusen zur Untersuchung ihrer pathogenen Mechanismen

Summary

Wir beschreiben ein in vivo Immunisierungs-, translationales Hepatitis-Modell bei BALB / c-Mäusen, das verwendet werden kann, um die Pathogenese der medikamenteninduzierten Autoimmunhepatitis einschließlich der bei dieser Krankheit beobachteten Geschlechtsunterschiede zu untersuchen. Wir werden beschreiben, wie dieses Modell reproduzierbare Analysen mit experimentellen In-vivo- und In-vitro-Techniken demonstriert.

Abstract

Die medikamenteninduzierte Autoimmunhepatitis (DIH) ist der häufigste hepatische medikamenteninduzierte Hypersensibilisierungsprozess, der bei etwa 9 bis 12% der Patienten mit Autoimmunhepatitis beobachtet wurde. Die überwiegende Mehrheit der Patienten mit DIH sind Frauen. Die zugrunde liegenden Mechanismen dieser Geschlechtsunterschiede in der Prävalenz sind unklar, da Tiermodelle, die menschliche Krankheiten nachahmen, fehlen. Dennoch wird allgemein angenommen, dass zugrunde liegende Mechanismen mit menschlichen Leukozyten-Antigen-Haplotypen und Sexualhormonen in Verbindung gebracht werden. Im Gegensatz dazu haben wir mit einem DIH-Mausmodell herausgefunden, dass IL-4-initiierte CD4 + T-Zellen, die gegen ein Epitop von Cytochrom P450 2E1 gerichtet sind, den Zustrom von Neutrophilen, Makrophagen und Mastzellen in die Lebern weiblicher BALB / c-Mäuse induzieren. Mit diesem Modell haben wir auch gezeigt, dass IL-33-induzierte FoxP3+regulatorische T-Zellen Schutz gegen DIH bei weiblichen und männlichen Mäusen bieten. Dieses DIH-Modell wird durch die Immunisierung von Mäusen mit einem Epitop von CYP2E1 induziert, das kovalent mit einem Arzneimittelmetaboliten verändert wurde, der mit DIH assoziiert wurde. Dieses Epitop wird von Patienten mit DIH erkannt. Unsere Methode induziert robuste und reproduzierbare Hepatitis- und Autoantikörper, die zur Untersuchung der Pathogenese von DIH verwendet werden können. Während In-vivo-Studien bei Mäusen übermäßige Schmerzen und Leiden verursachen können, wenn sie unsachgemäß durchgeführt werden, besteht der Vorteil eines In-vivo-Modells in der Fähigkeit, die Krankheitserregung bei einer großen Anzahl von Mäusen zu bewerten. Zusätzlich können biologische Effekte der veränderten Leberproteine mit invasiven Verfahren untersucht werden. Die Ergänzung des experimentellen Designs um In-vitro-Studien ermöglicht eine schnelle Wiederholung und mechanistische Analyse auf zellulärer Ebene. So werden wir unser Modellprotokoll demonstrieren und wie es verwendet werden kann, um In-vivo- und In-vitro-Mechanismen von DIH zu untersuchen.

Introduction

Der Zweck dieser Methode ist es, ein Mausmodell der medikamenteninduzierten Autoimmunhepatitis zu beschreiben, das sich in vivo entwickelt, und zu zeigen, wie es verwendet werden kann, um die molekularen, immunologischen und genetischen Grundlagen dieser Krankheit zu untersuchen. Das langfristige Ziel unserer Studien ist es, Mechanismen aufzudecken, die für die Entstehung chronischer Leberentzündungen und -verletzungen verantwortlich sind, indem wir DIH bei anfälligen Patienten untersuchen. Lebererkrankungen und Zirrhose stellen die sechsthäufigste Todesursache bei Erwachsenen zwischen 25 und 64 Jahren dar. Idiosynkratische DILI, manchmal auch als medikamenteninduzier....

Protocol

Alle Verfahren wurden vom Komitee für Tierpflege und -verwendung genehmigt.

1. Trifluoracetylierung hepatischer S-100-Zytosolproteine oder eines CYP2E1-Epitops

HINWEIS: Bereiten Sie zunächst das trifluoracetylierte S100 (TFA-S100) und das trifluoracetylierte CYP2E1-Epitop (TFA-JHDN5) vor. Weil syngene S100-Proteine für Impfungen benötigt werden und BALB / c-Mäuse benötigt werden, um das Immunogen zu produzieren. Das Präparat liefert eine große Menge an Immunogen; Also, erwarten Sie, diesen Teil etwa viermal im Jahr durchzuführen. Eine identische Methode wird verwendet, um den TFA-JHDN5 herzustellen. Das CYP2E1-Epit....

Results

Der in Abbildung 1 gezeigte Impfplan, der zur Induktion von DIH verwendet wird, stellt die beiden Impfungen dar, die an der Basis des Halses (Tag 0) und an der Basis des Schwanzes (Tag 7) erforderlich sind. Abbildung 2 zeigt repräsentative Proliferationsdaten, die am Tag 14 unter Verwendung von CFSE als Reaktion auf CYP2E1, JHDN5, das CYP2E1-Epitop und den Trifluoracetyl (TFA)-Metaboliten der Anästhetika erhalten wurden. Abbildung 3.......

Discussion

Die Stärke dieses Protokolls liegt in seiner Reproduzierbarkeit; Daher ist es wichtig, sich an die vorgeschlagenen Schritte zu halten. Die Formulierung des Immunogens kann für einige eine Barriere sein; Wir haben unser Modell jedoch mit dem in unserem Dokument beschriebenen Epitop reproduziert, wodurch die Notwendigkeit, die S100-Fraktion der Leber zu isolieren, entfällt. Es ist wahrscheinlich, dass zusätzliche Epitope oder Proteine nach Impfungen verändert werden können und Hepatitis induzieren; Wir beschreiben jedoch d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,1% 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS)	ThermoFisher	28997
AKP Substrat Kit	BioRad	172-1063
BALB/c Mäuse	Jackson
CellTrace™ CFSE Zellproliferationskit	ThermoFisher	C34554
CFA H37Ra	Becton Dickinson (Difco Bacto)	231131
FcR Blockierungsreagenz	Milteyi	130-092-575
Allgemeine Ergänzung	ThermoFisher	HPRG770
HepaRG™ Zellen kryokonserviert	ThermoFisher	HPR GC10
Lebend/tot fixierbar Aqua Dead Cell Färbeset	ThermoFisher	L34965
NaHC03	Millipore Sigma	S5761
Percoll®	Millipore Sigma	P1644-1L
Pertussis Toxin	Liste Biologicals	180
Phosphat gepufferte Kochsalzlösung pH 7,4	Verschiedenes
Pierce&Trade; Proteasehemmer Mini-Tabletten, EDTA-frei	ThermoFisher	88666
Kaliumhydroxid	JT Baker	3140-01
S-Ethyltrifluorthioacetat (S-ETFA)	Millipore Sigma	177474
Slide-a-Lyzer Dialysekassetten (10 K, 12 ml)	ThermoFisher	66810
UltraPure™ SDS-Lösung, 10%	ThermoFisher	24730020
Williams Media E, kein phenolrotes	ThermoFisher	A1217601