Summary

生化神経建築研究における工学的神経前駆体の脳内移植

Published: May 11, 2019
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Summary

神経前駆体のインビトロレンチウイルス工学、野生型脳への共同移植、および「テスト」および「コントロール」誘導体の対対モルモメトリック評価に基づいて、この方法は、新生児の生体内遺伝子制御における正確なモデリングを可能にするシンプルで手頃な方法でニューロン形態。

Abstract

ニューロン細胞構造の遺伝子制御は、現在、集中的な研究の対象である。ここで説明する、新生物投影ニューロン形態の生体内遺伝子制御を研究するために開発された簡単な方法である。この方法は、(1)ニューロン前駆体の「試験」および「制御」細胞のインビトロレンチウイルス工学、(2)野生型脳へのそれらの共移植、および(3)それらの神経誘導体の対対形態評価に基づいている。具体的には、この目的のために、パンニューロン由来のE12.5pallial前駆体、遺伝的標識ドナーが用いられる。それらは選択されたプロモーターおよびtetON/OFFの技術を利用するように設計され、新生児の横心室に自由に移植される。その後、レシピエント脳の免疫蛍光プロファイリングに際して、移植されたニューロンのシルエットをNeurphologyJオープンソースソフトウェアに送り込み、それらの形態パラメータを抽出し、平均長さと分岐指数を算出する。他の方法と比較して、この1つは3つの主要な利点を提供する:それは手頃な費用でトランスジーン発現の細かい制御を達成することを可能にし、それは基本的な外科的スキルを必要とし、限られた分析の場合に統計的に信頼できる結果を提供する動物の数。しかし、その設計のため、神経アーキテクチャの非細胞自律制御に対処するには不十分です。さらに、神経移動の完了後にニューライト形態制御を調べるために好ましくは用いるべきである。本製剤では、この方法は、グルタマチング性新生物神経系統アーキテクチャの遺伝子制御を調べるために絶妙に調整されている。EGFPを発現するトランスジェニックラインを他の特定の神経細胞タイプで利用して、そのアーキテクチャの遺伝子制御に対処するために再利用することができる。

Introduction

ここでは、ニューロン細胞構造の生体内遺伝子制御を解剖するために開発した簡単な方法について述述びます。神経前駆体のインビトロ工学に基づいて、新生児脳への移植と「テスト」および「制御」細胞の対化形態評価に基づいて、ニューロン形態の細かい制御における試験遺伝子の機能的影響を明らかにすることができる。高速かつ手頃な価格の方法。ニューロンアーキテクチャの生体内遺伝子制御を調べるには、(1)適切にパターン化された遺伝子(GOI)発現と正確な定量的制御の達成という3つの重要な技術的課題に取り組む必要があります。(2)異なるニューロンシルエットの適切にセグメント化された可視化を得ること。(3)限られた数の動物を用いながら、結果の統計的有意性を引き出す。

利用可能な場合、テトラサイクリン(tet)制御トランスジーンを収容するマウス変異線は、最初の問題1に対処するための最良のツールである可能性があります。あるいは、体性トランスジェネシスが採用されてもよい。このような場合、トランスジーンは、エレクトロポレーション2またはウイルス伝達3を介して送達される。次に、エピソームとして保持される(例えば、標準的なエレクトロポレーション4)、またはゲノムに統合される(ランダムに、レトロウイルスインテグラーゼ5;または定義された場所に、CRISPR促進相同組換え(SLENDR)6).

第二に、ニューロンシルエット可視化は、(a)まばらな均一標識または(b)緻密な差分標識を介して達成され得る。まばらな標識に関しては、高度なゴルジ様方法論7を用いてもよいし、選択されたニューロンミニセットはバイオシシン8で充填することができ、また、まばらに発現したトランスジーンのおかげで塩およびコショウ標識を得ることができる。このようなトランスジーンは、可変転写(Thy-EGFP)9を表示してもよいし、確率的組換え(MORF)10によって活性化されてもよい。(b)に関しては、最先端の戦略には、多フロキ散性フルオロプロテイントランスジーン配列(Brainbow)11内のクレ媒介確率的組換え、ならびにピギーバクトランスポサーゼ駆動のフルオロタンパク質遺伝子のゲノム統合が含まれる。体細胞トランスジェネシス(CLoNE)12を介して配信されます。

第3の問題に関しては、形態学的結果は、多くの場合、動物間の違いと細胞注入の不測の事態に起因する大きなランダム変動の影響を受けます。このため、GOI形態測定活性を評価するために必要な統計的な力を達成するために、通常、多数の動物が使用されます。

前述のアプローチは、高度な技術的スキルに依存することが多く、目立つ財源を必要とし、科学界内での拡散を制限する可能性があります。これらの問題を回避するために、我々は迅速かつ手頃な方法で生体内の神経構造の遺伝子制御を解剖するための簡単で簡単なパイプラインを考案しました。これは、抗芽細胞トランスジーン活性13の高速生体内評価のために以前に開発された同様の共同移植設計に触発される。

具体的には、インビトロで「緑色」の神経前駆体(「テスト」と「制御」細胞)を「黒」レシピエント新生児脳に同時に移植すると、上記の3つの重要な問題を同時に修正できると考えられている。実際、前駆体のインビトロレンチウイルス工学では、十分に制御された条件下で、ニューロントランスジーン発現の変動性の維持を可能にし、通常は生体内の体系操作に関連するよりもはるかに低い(以前に行われた)14歳,15と私たちの未発表の結果で)。得られた遺伝子発現の正確な制御は、tet制御トランスジェニックモデルによって達成されるものと同等である。しかし、この手順のコストは、トランスジェニックマウスラインのメンテナンスに起因するものよりもはるかに低いです。次に、自由な手の細胞注入は容易で、最低の訓練を必要とする。さらに、各脳に注入される標識された前駆体の量は、移植された動物の総数を最小限に抑えながら、まばらに分布する前駆体の十分な累積数を達成するために容易に調整することができる。最後に、異なるフルオロ標識の共注入、”テスト”と”制御”前駆体およびその後のペアワイズ統計分析は、動物間実験変動の影響を打ち消し、結果の統計的有意性は、限られた数の個人の分析でも13.

高速かつ安価であるにも関しては、この方法には2つの主な制限があることを強調する必要があります。第一に、神経構造の細胞自律遺伝子制御を調べるように設計されており、環境制御に取り組むのは適切ではない。第二に、移植された神経前駆体がヘテロクロニクススケジュールによって最終位置に達するにつれて、この方法は、過去の移行完了が起こる神経設計制御をモデル化することが好ましい。

Protocol

ここに記載されているすべての方法および手順は、SISSAオルガニスト・アル・ベネッセア・アニマル(SISSA IACUC)によって承認されています。 1. エンジニアリングされた「グリーン」前駆子プールの生成 「緑」プールの準備 MtaptEGFP/+創設者16と野生型 CD1 メスを合致します。12.5日後の子宮頸部脱臼により妊娠中の?…

Representative Results

手順の主要な側面に関する有用な情報を提供する5つの主要なデータセットがあり、最初のは(1)レンチウイルスベクターによる神経前駆体の伝達および共伝導の効率である。(2)「試験遺伝子」を駆動するために用いられるプロモーターの主な特徴の一例。(3)移植準備ができている工学的細胞の例。(4)新生児脳への細胞マイクロインジェクションの主要な手続き上の詳細…

Discussion

この手順の特定の側面/手順は重要であり、特別な注意が必要です。第一に、(a)オペレータは、BSL-2準拠のラボ環境でレンティウイルスを安全に操作するために十分な事前訓練を受ける必要があります。第二に、(b)神経製剤を混合する前に、必要に応じて2つの対応する神経球懸濁液を慎重に洗浄することが必須であり、不要なレンチウイルスによる2つの製剤の遅延クロス感染を防ぐために引?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

私たちは、この手順の早期設定に彼の貢献のためにMihn Duc Doに感謝します。

Materials

0.3 mL syringe BD 320840 store at RT
0.45 μm sterile filter Millex-HV SLHU033RS store at RT
12 multiwell plate Falcon 353043 store at RT
1X PBS Gibco 14190-094 store at RT
24 multiwell plate Falcon 351147 store at RT
anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416 Tebubio GTX13970 store at -20 ℃
anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839 Antibodies Online ABIN334653 store at +4 ℃
anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773 Covance MMS-435P store at -20 ℃
Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes Sigma A5177-5EA store at RT
Blue light lamp Nightsea BLS2 store at RT
Borosilicate capillaries Kwik-Fil TW150-4 store at RT
BSA Sigma A9647 store at +4 ℃
Bürker chamber Sigma BR719520 0.0025 mm2, 0.100 mm
Cryo-inclusion medium (Killik) Bio-Optica 05-9801 store at RT
DAPI Sigma D9542 store at +4 ℃
Disposable embedding mold Bio-Optica 07MP7070 DispoMold07
DMEM/F-12 Gibco 31331-028 store at +4 ℃
Dnase I Roche 10104159001 store at +4 ℃
Doxycicline Sigma D1822 store at +4 ℃
Dumont forceps #3c Fine Science Tools 11231-20 store at RT
Dumont forceps #5 Fine Science Tools 11251-20 store at RT
EGF Gibco PHG0311 store at -20 ℃
EGTA Sigma E3889 store at RT
FGF Gibco PHG0261 store at -20 ℃
Fine scissors – Sharp Fine Science Tools 14060-09 store at RT
Fungizone (Amphotericin B) Gibco 15290018 store at -20 ℃
Glucose Sigma G8270 store at RT
GlutaMAX Supplement Gibco 35050061 store at RT
Goat anti-chicken Alexa 488 Invitrogen A11039 store at -20 ℃
Goat anti-rat Alexa 594 Invitrogen A11007 store at -20 ℃
Heparin Solution Stem Cell Technologies 07980 store at +4 ℃
N2 Supplement Gibco 17502048 store at -20 ℃
Optical fibers Leica CLS150X store at RT
P1000 puller Sutter Instruments P-1000 model Flaming/Brown Micropipette Puller
Parafilm Bemis PM-996 store at RT
Pen Strep Sigma P0781 store at -20 ℃
Petri dish Falcon 353003 store at RT
PFA Sigma 158127 store at RT
Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP] built in house
Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry] built in house
Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)] built in house
Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)] built in house
Plasmid #484 [LV_lacZ] Addgene 12108
Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry] built in house
Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)] built in house
Scalpel Braun BB515 store at RT
Steromicroscope Leica MZ6 store at RT
Trypan blue Gibco 15250-061 store at RT
Trypsin Gibco 15400-054 store at -20 ℃
Trypsin inhibitor Sigma T6522 store at +4 ℃

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Chiola, S., Santo, M., Mallamaci, A. Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies. J. Vis. Exp. (147), e59242, doi:10.3791/59242 (2019).

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