Hier stellen wir ein Protokoll zur Messung des KDM1A-Zielengagements in einer menschlichen oder tierischen Zelle, Gewebe oder Blutproben vor, die mit KDM1A-Hemmern behandelt werden. Das Protokoll verwendet Chemoprobe-Tagging des freien KDM1A-Enzyms und direkte Quantifizierung des Zielbegebungsmittels mittels chemoprobebasierter Immunoassays und kann in präklinischen und klinischen Studien eingesetzt werden.
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Methodenartikel
Direkte Messung des KDM1A Target Engagements mit Chemoprobe-basierten Immunoassays
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Bewertung des Zielengagements, definiert als die Wechselwirkung eines Arzneimittels mit dem Protein, für das es entwickelt wurde, ist eine Grundvoraussetzung für die Interpretation der biologischen Aktivität jeder Verbindung in der Arzneimittelentwicklung oder in Grundlagenforschungsprojekten. In der Epigenetik wird das Zielengagement am häufigsten durch die Analyse von Proxy-Markern bewertet, anstatt die Vereinigung der Verbindung zum Ziel zu messen. Zu den nachgelagerten biologischen Auslesungen, die analysiert wurden, gehören die Histonmarkmodulation oder Genexpressionsänderungen. KDM1A ist eine Lysindemethylase, die Methylgruppen aus mono- und dimethyliertem H3K4 entfernt, eine Modifikation, die mit dem Silencing der Genexpression verbunden ist. Die Modulation der Proxy-Marker hängt vom Zelltyp und der Funktion der genetischen Ausgestaltung der untersuchten Zellen ab, was die Interpretation und den Cross-Case-Vergleich recht schwierig machen kann. Um diese Probleme zu umgehen, wird ein vielseitiges Protokoll vorgestellt, um die Dosiseffekte und die Dynamik des direkten KDM1A-Zielengagements zu bewerten. Der beschriebene Test nutzt eine KDM1A-Chemoprobe, um hemmungsloses Enzym zu erfassen und zu quantifizieren, kann ohne genetische Veränderung breit auf Zellen oder Gewebeproben angewendet werden, verfügt über ein ausgezeichnetes Nachweisfenster und kann sowohl für die Grundlagenforschung verwendet werden. und Analyse klinischer Proben.
Einleitung
Lysin-spezifische demethylase 1 (KDM1A)1 ist eine Demethylase, die an der Kontrolle der Gentranskription beteiligt ist. Dieses Protein hat sich als Kandidat pharmakologisches Ziel2 in der Onkologie herauskristallisiert; einschließlich Akute myeloische Leukämie3 (AML), Myelodysplasie-Syndrom (MDS)4, Myelofibrose (MF)5,6, Kleinzelllungenkrebs (SCLC)7; bei Sichelzellerkrankungen (SCD)8,9, und bei Erkrankungen des zentralen Nervensystems ....
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Protokoll
Blutproben wurden vom Instituto de Investigacion Biomédica Sant Pau Biobank nach spanischem Recht (Real Decreto de Biobancos 1716/2011) und der Genehmigung der lokalen Ethikkommissionen entnommen. Die Untersuchungen mit tierischem Gewebe wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren (Richtlinie 86/609/EWG des Rates der Europäischen Gemeinschaften) durchgeführt, die vom Ethikausschuss für Tierversuche auf der PRAAL-PCB.
1. Herstellung biologischer Proben für den Test.
VORSICHT: Dieses Protokoll beinhaltet die Manipulation biologischer Proben, die....
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Ergebnisse
Die Linearität der Total- und Free KDM1A-Bestimmung.
Eine Standard-Serie wurde wie in Schritt 5.3.2. beschrieben unter Verwendung von 0 bis 2500 pg des humanen rekombinanten KDM1A-Enzyms in voller Länge hergestellt. Die RLU-Werte von Total und Free rKDM1A wurden bewertet, um die Linearität zu überprüfen (Abbildung 2A und 2B). Die Daten werden als Mittelwert aus 3 Ex.......
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Diskussion
Das hier vorgestellte Protokoll wurde entwickelt, um das KDM1A-Zielengagement direkt mit einem neuartigen KDM1A Chemoprobe Capture-basierten ELISA zu messen. Die Methode wurde an kultivierten menschlichen Zelllinien und Ex-vivo-Proben von Mensch, Ratte und Maus und Pavian (einschließlich PBMCs, Lunge, Gehirn, Haut, Tumoren) validiert, kann aber leicht auf andere Arten angewendet werden, bei denen die KDM1A-Antikörper Epitope und katalytische Mitte konserviert werden. Da OG-881 eine aktivitätsbasierte Chemoprobe ist, ist .......
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Offenlegungen
Die Autorin Tamara Maes ist geschäftsführende Direktorin und Aktionärin, und die Autoren Cristina Mascara und Raquel Ruiz Rodriguez sind Mitarbeiter von Oryzon Genomics S.A. Oryzon Genomics S.A. entwickelt KDM1A-Inhibitoren und hält Patente für Verbindungen und Methoden in diesem Artikel.
Danksagungen
Diese Studie wurde von Oryzon Genomics finanziert. S.A., Hoffman-La Roche, teilweise unterstützt durch das CIIP-20152001 und RETOS Kollaborationsprogramm RTC-2015-3332-1.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,05% Trypsin-EDTA (1X) | Thermo Scientific | #25300-062 | |
| 10 x Proteasehemmer Tabletten | Roche | #11836153001 | |
| 96 Deep Well Lagerblock | VWR | #734-1679 | |
| 96 Well ELISA Platten | Nunc | #436110 | |
| Kleber schwarz Film | Perkin Elmer | #6050173 | |
| Kleber transparente Folie | VWR | #60941-062 | |
| Biotinylierte KDM1A-Sonde OG-881 | Oryzon Genomics S.A. | ||
| Rinderserumalbumin | Sigma | # 3117057001 | |
| Rinderserumalbumin Standard | Thermo Scientific | #23208) | |
| Bradford Protein Assay | BioRad | #500-0001 | |
| Zelllysepuffer 10X | Zellsignalisierung | #9803 | |
| Zentrifuge für 96-Well-Platten | Hettich | Rotina 420R | |
| Flasche | Thermo Scientific | #156499 | |
| In voller Länge, enzymatisch aktiv humanes rekombinantes LSD1 / KDM1A | aktives Motiv | #31426 | |
| Graphpad Prism 5 Project | GraphPad Software | NA | |
| Luminol-Enhacer und Peroxidlösung (Chemilumineszenzsubstrat) | Thermo Scientific | #37074 | |
| Mikrozentrifuge | Eppendorf | 5415 R | |
| Mikroplatten-Reader Infinite 200-Tecan | Tecan | Infinite 200 | |
| Maus monoklonaler Capture-Antikörper Anti-KDM1A (N-terminales Epitop) | Abcam | #ab53269 | |
| Nadel G18 Gauge stumpf | BD | #303129 | |
| ORY-1001 (iadademstat) | Oryzon Genomics S.A. | ||
| PBMC Trenngefäße 10 ml | Greiner bio-one | #163288 | |
| PBMC Trenngefäße 50 ml | Greiner bio-one | #227288 | |
| PBS 1x | Sigma | #D8537 | |
| Plattenschüttler | Heidolph Instruments | Rotamax 120 | |
| Polysorbat 20 | Sigma | #P7949 | |
| Monoklonaler Detektionsantikörper für Kaninchen Anti-KDM1A (C-terminales Epitop) | Zellsignalisierung | #672184BF-100 | |
| Sekundärer Antikörper Peroxidase-konjugierter Esel Anti-Kaninchen IgG | Thermo Scientific | #31458 | |
| Spektralphotometer Küvette 1,5 | Deltalab | #302100 | |
| Spektralphotometer für Küvette | GE Healthcare | GeneQuant 1300 | |
| Streptavidin | Promega | #Z704A | |
| Spritze | BD | #303172 | |
| Typ 1 Reinstwasser | Millipore Milli-Q | Advantage A10 | |
| Ultraschallreiniger | VWR | USC200T |
Referenzen
- Shi, Y. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell. 119 (7), 941-953 (2004).
- Maiques-Diaz, A., Somervaille, T. C. LSD1: biologic roles and therapeutic targeting. Epigenomics. 8 (8), 1103-1116 (2016).
- Maes, T.
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Nachdrucke und Genehmigungen
