Diese Methode bietet einen Rahmen für die Untersuchung der Einbeziehung von exogenen Fettsäuren aus komplexen Wirtsquellen in bakterielle Membranen, insbesondere Staphylococcus aureus. Um dies zu erreichen, werden Protokolle zur Anreicherung von Lipoproteinpartikeln aus Hühnereigelb und anschließende Fettsäureprofilierung von bakteriellen Phospholipiden unter Verwendung der Massenspektrometrie beschrieben.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Isolierung von Lipoproteinpartikeln aus Hühnereigelb zur Untersuchung des bakteriellen Pathogens Fettsäure-Inkorporation in Membranphospholipide
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Staphylococcus aureus und andere grampositive Erreger integrieren Fettsäuren aus der Umwelt in Membranphospholipide. Während der Infektion sind die meisten exogenen Fettsäuren in Wirtslipoproteinpartikeln vorhanden. Ungewissheit bleibt hinsichtlich der Reservoirs von Wirtsfettsäuren und der Mechanismen, durch die Bakterien Fettsäuren aus den Lipoproteinpartikeln extrahieren. In dieser Arbeit beschreiben wir Protokolle zur Anreicherung von Lipoproteinpartikeln mit geringer Dichte (LDL) aus Hühnereigelb und bestimmen, ob LDLs als Fettsäurereservoirs für S. aureusdienen. Diese Methode nutzt unvoreingenommene lipidomische Analysen und Hähnchen-LDLs, ein effektives und wirtschaftliches Modell für die Erforschung von Wechselwirkungen zwischen LDLs und Bakterien. Die Analyse der Integration von exogenen Fettsäuren aus LDLs wird mit hoher Auflösung/genauer Massenspektrometrie und Tandemmassenspektrometrie durchgeführt, die die Charakterisierung der Fettsäurezusammensetzung der bakteriellen Membran und unvoreingenommene Identifizierung neuartiger Kombinationen von Fettsäuren, die bei Exposition gegenüber LDLs in bakteriellen Membranlipiden entstehen. Diese fortschrittlichen Massenspektrometrietechniken bieten eine unvergleichliche Perspektive der Aufnahme von Fettsäure, indem sie die spezifischen exogenen Fettsäuren, die in die Phospholipide eingearbeitet sind, offenlegen. Die hier beschriebenen Methoden sind an die Untersuchung anderer bakterieller Krankheitserreger und alternativer Quellen komplexer Fettsäuren anpassungsfähig.
Einleitung
Methicillin-resistente S. aureus (MRSA) ist die Hauptursache für gesundheitsbezogene Infektionen und die damit verbundene Antibiotikaresistenz ist eine erhebliche klinische Herausforderung1,2,3. Daher hat die Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien einen hohen Stellenwert. Eine vielversprechende Behandlungsstrategie für Gram-positive Krankheitserreger ist die Hemmung der Fettsäuresynthese, eine Anforderung für die Membranphospholipid-Produktion, die in S. aureusPhosphatidylglycerol (PG), Lysyl-PG und Cardiolipin4umfasst. Bei....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
HINWEIS: Das folgende Protokoll zur Anreicherung von LDL-Partikeln aus Hühnereigelb stammt von Moussa et al. 200233.
1. Herstellung von Hühnereigelb zur Anreicherung von LDL-Partikeln
- Zwei große Hühnereier durch Waschen der Schalen mit 70% Ethanollösung sanieren und lufttrocknen lassen.
- Den Eiabscheider mit 70% Ethanollösung desinsieren und lufttrocknen lassen. Befestigen Sie den Eiabscheider an der Lippe eines mittelgroßen Bechers.
- Knacken Sie jedes Ei einzeln in den Eiabscheider und lassen Sie das Albumin in den Becher fließen. Das intakte Eigelb wird vom Separator zurückgehalten. ....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Das Protokoll zur Anreicherung von LDL aus Hühnereigelb ist in Abbildung 1dargestellt. Dieser Prozess beginnt mit der Verdünnung von ganzem Eigelb mit Kochchen und der Trennung der Eigelbfeststoffe, die als Granulat bezeichnet werden, von der löslichen oder Plasmafraktion, die die LDLs enthält (Abbildung 1)33. Der LDL-Gehalt der Plasmafraktion wird durch die Ausfällung der 30-40 kDa-Livetine (Abbildung
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
S. aureus integriert exogene Fettsäuren in seine Membranphospholipide27,32,43. Die Phospholipidsynthese mit exogenen Fettsäuren umgeht die FASII-Hemmung, verändert aber auch die biophysikalischen Eigenschaften der Membran27,32,44. Während die Aufnahme von exogenen Fettsäuren in Phospholipide grampositiver Erreger gut dokumentie.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben keine Angaben.
Danksagungen
Wir danken den Mitgliedern des Hammer Labors für die kritische Bewertung des Manuskripts und die Unterstützung dieser Arbeit. Dr. Alex Horswill von der University of Colorado School of Medicine stellte freundlicherweise AH1263 zur Verfügung. Dr. Chris Waters Labor an der Michigan State University lieferte Reagenzien. Diese Arbeit wurde durch das Stipendium der American Heart Association 16SDG30170026 und Start-up-Fonds der Michigan State University unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Ammoniumsulfat | Fisher | BP212R-1 | ≥ 99,5% reiner |
| Zellkultur-Inkubator | Thermo | MaxQ 6000 | |
| Centrafuge | Thermo | 75-217-420 | Sorvall Legen XTR, Rotor F14-6x250 LE |
| Costar Assay Plate | Corning | 3788 | 96 well |
| Filterpapier | Schleicher & Schuell | 597 | |
| Großes Hühnerei | N/A | N/A | Gewöhnlich im Laden gekauftes Ei |
| Mikroplatten-Spektralphotometer | BioTek | Epoche 2 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| S. aureus Stamm AH1263 | N/A | N/A | Bereitgestellt von Alex Horswill von der University of Colorado |
| Dialyseschlauch | Pierce | 68700 | 7.000 MWCO |
| Trypton | Becton, Dickison and Company | 211705 | |
| 0,5 mm Zirkonoxidkügelchen | Weiter Advance | ZROB05 | |
| Bullet Blender | Weiter Advance | BBX24B | |
| Methanol (LC-MS-Qualität) | Fisher | A4561 | |
| Chloroform (Reagenzqualität) | Fisher | MCX10559 | |
| Isopropanol (LC-MS-Qualität) | Fisher | A4611 | |
| Dimyristoylphosphatidylcholin | Avanti Polare Lipide | 850345C-25mg | |
| Ammoniumbicarbonat | Sigma | 9830 | ≥ 99,5 % reines |
| Ammoniumformiat | Sigma | 70221-25G-F | |
| Xcalibur-Software | Thermo Scientific | OPTON-30801 | |
| LTQ-Orbitrap Velos Massenspektrometer | Thermo Scientific | hochauflösende/genaue Masse MS | |
| Agilent 1260 Kapillar-HPLC | Agilent | ||
| SpeedVac Vakuumkonzentratoren | Thermo Scientific |
Referenzen
- Noskin, G. A., et al. National trends in Staphylococcus aureus infection rates: impact on economic burden and mortality over a 6-year period (1998-2003). Clinical Infectious Diseases. 45 (9), 1132-1140 (2007).
- Noskin, G. A., et al.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
