Bestimmung der Gallengangsdichte in der Mausleber

Summary

Wir präsentieren eine recht einfache und empfindliche Methode zur genauen Quantifizierung der Gallengangsdichte in der Mausleber. Diese Methode kann bei der Bestimmung der Auswirkungen von genetischen und ökologischen Modifikatoren und der Wirksamkeit potenzieller Therapien in Mausmodellen von Gallenerkrankungen helfen.

Abstract

Maus wird allgemein als Modellorganismus verwendet, um Gallenkrankheiten zu untersuchen. Um die Entwicklung und Funktion des Gallensystems zu bewerten, werden verschiedene Techniken verwendet, einschließlich Serumchemie, histologische Analyse und Immunostainierung für bestimmte Marker. Obwohl diese Techniken wichtige Informationen über das Gallensystem liefern können, stellen sie oft kein vollständiges Bild der Gallengang (BD) Entwicklungsfehler in der gesamten Leber dar. Dies ist zum Teil auf die robuste Fähigkeit der Mausleber zurückzuführen, die Galle auch bei Tieren mit erheblichen Beeinträchtigungen in der Gallenentwicklung zu entwässern. Hier stellen wir eine einfache Methode zur Berechnung der durchschnittlichen Anzahl von BDs vor, die jeder Portalvene (PV) zugeordnet sind, in Abschnitten, die alle Lappen mutierter/transgener Mäuse abdecken. Bei dieser Methode werden Lebern in einer stereotypen Weise montiert und geschnitten, um den Vergleich zwischen verschiedenen Genotypen und experimentellen Bedingungen zu erleichtern. BDs werden mittels Lichtmikroskopie von Cytokeratin-gefärbten Cholangiocyten identifiziert und dann gezählt und durch die Gesamtzahl der im Leberbereich vorhandenen PVs dividiert. Als Beispiel zeigen wir, wie diese Methode klar zwischen Wildtypmäusen und einem Mausmodell des Alagille-Syndroms unterscheiden kann. Die hier vorgestellte Methode kann keine Techniken ersetzen, die die dreidimensionale Struktur des Gallenbaums visualisieren. Es bietet jedoch eine einfache und direkte Möglichkeit, die BD-Entwicklung und den Grad der kanalulären Reaktionsbildung bei Mäusen quantitativ zu bewerten.

Introduction

Der Gallenbaum ist ein kritischer Teil der Säugetierleber, so dass der Durchgang der Galle von Hepatozyten in den Darm ermöglicht. Intrahepatische Gallengänge (BDs) werden durch Cholangiozyten gebildet, die sich von bipotenten Hepatoblasten durch Notch und TGF-Signalisierung^1,2unterscheiden. Die richtige Spezifikation und Das Richtige Engagement von Cholangiocyten und deren Montage in ausgereifte BDs sind entscheidend für die Entwicklung des intrahepatischen Gallenbaums. Da die Leber während der Entwicklung oder bei der Organregeneration wächst, muss sich das Gallensystem entlang der Leber entwickeln, um eine ....

Protocol

Alle Tiere wurden in einer Barrieretieranlage am Baylor College of Medicine gemäß den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee und gemäß den genehmigten Tierprotokollen untergebracht.

1. Sammlung von Maus Lebergewebe

1. Vorbereitung der Maus für die Leberernte
   1. Euthanisieren Sie die Maus mit Isofluran.
   2. Führen Sie zervikale Dislokation der Maus, um den Tod zu gewährleisten.
   3. Machen Sie einen Querschnitt etwa einen Zoll unter dem Rippenkäfig.
   4. Setzen Sie die gesamte ventrale Oberfläche der Leber aus.
2. Sammlung der Mausleber

Results

Wir haben bereits Gallendefekte bei Jag1+/– Tieren dokumentiert, einem Mausmodell von ALGS⁸. Um das BD-PV-Verhältnis zu bestimmen, haben wir P30-Mausleber geschnitten und für CK8 und CK19 (wsCK) zusammen mit dem Gefäßmarker SMA mitgefärbt. Wir haben dann alle PVs in jedem der Leberlappen abgebildet. Wie in Abbildung 2Adargestellt, haben wir PVs als "SMA-befleckte Gefäße" definiert, die benachbarte wsCK-Färbung (Pfeilspitzen) h.......

Discussion

Die Analyse der BD-Entwicklung und -Reparatur bei Mäusen ist ein wichtiges Instrument zur Untersuchung der Pathogenese und des Mechanismus cholestatischer Erkrankungen. Darüber hinaus hängt die Entwicklung neuer Therapien zum Teil von der Etablierung eines reproduzierbaren und vorzugsweise quantifizierbaren Phänotyps ab. Aktuelle Phänotypisierung in Mausmodellen beinhaltet in der Regel Serumchemie, Leberhistologie und Immunostainierung für zelltypspezifische Marker. Obwohl diese Techniken wertvolle Informationen über die.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isothesie (Isofluran)	Henry Schein	11695-6776-2
Exsikkator	Bel-Art	16-800-552
10% PFA	Elektronenmikroskopie Sciences	15712
50 mL Röhrchen	ThermoScientific	339653
70% Ethanol	Dekon Laboratorien	2401
95% Ethanol	Dekon Laboratories	2801
100% Ethanol	Decon Laboratories	2701
HistoChoice	VWR Life Sciences	H103-4L	Clearingmittel
Omnisette Tissue Cassette	Fisher HealthCare	15-197-710E
Macrosette	Simport	M512
Paraplast X-TRA	McCormick Scientific	39503002	Parrafin
Tissue Mold	Fisher Scientific	62528-32
Mikrotom	Microm	HM 325
Superfrost Plus Objektträger	Fisher Scientific	12-550-15
Xylol	Fisher Scientific	C8H10
Tris-basiertes Antigen Retrieval	Vector Laboratories	H-3301
Druck Kocher	Instant Pot	Lux Mini
Mini Pap Pen	Life Technologies	8877
Polyoxyethylen 20 Sorbitanmonolaurat (Tween-20)	J.T. Baker	X251-07
Octylphenolethoxylat (Triton-X-100)	J.T. Baker	X198-07
Normales Ziegenserum	Jackson Immunoresearch	005-000-121
anti-CK8	Developmental Studies Hybridoma Bank	TROMA-I	Antibody Registry ID AB531826
anti-CK19	Developmental Studies Hybridoma Bank	TROMA-III	Antibody Registry ID AB2133570
anti-αSMA	Sigma Aldrich	A2547, Clone 1A4
anti-rat-Alexa488	ThermoFisher	A21208
anti-mouse-Cy5	Jackson Immunoresearch	715-175-151
DAPI	Vector Laboratories	H-1000
22 x 50 mm2 Micro Cover Glass	VWR Life Sciences	48393 059
Fluoreszenzmikroskop	Leica	DMI6000 B
Kimwipes	Kimtech Science	05511
VECTASHIELD	Vector Laboratories	H-1000	Antifade-Eindeckmedium