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Diese Methode beschreibt die Kultur von 40 perfusableen endotheliale Mikrogefäßen innerhalb einer robusten und skalierbaren mikrofluidischen Zellkulturplattform. Im Vergleich zu herkömmlichen 2D- und 3D-Zellkulturmethoden zeigt diese Methode, wie eine physiologisch relevante zelluläre Mikroumgebung, die Gradienten und kontinuierliche Perfusion umfasst, mit einer 3D-Zellkultur mit angemessenem Durchsatz für das Screening kombiniert werden kann. Zwecke.
Einer der Hauptvorteile gegenüber vergleichbaren mikrofluidischen Assays ist, dass diese Methode nicht auf Pumpen für die Perfusion angewiesen ist, sondern eine Rockerplattform verwendet, um eine kontinuierliche Perfusion in allen mikrofluidischen Einheiten gleichzeitig zu induzieren. Dadurch wird sichergestellt, dass der Assay robust und skalierbar ist: Platten können auf einer Rockerplattform gestapelt werden. Wichtig ist, dass alle mikrofluidischen Einheiten individuell adressierbar bleiben, was es ermöglicht, diese Methode im Arzneimittelscreening einschließlich der Erzeugung einer Dosis-Wirkungs-Kurve umzusetzen. Darüber hinaus ist ohne Pumpe, Bildgebung und Mittlerer Austausch viel einfacher mit geringerem Risiko einer (Kreuz-)Kontamination.
Ein weiterer Vorteil dieser Methode ist die Nutzung einer standardisierten, vorgefertigten Plattform, während vergleichbare mikrofluidische Zellkulturplattformen von den Endnutzern hergestellt werden müssen. Diese Verfügbarkeit erleichtert die Annahme dieses Assays bei anderen akademischen und pharmazeutischen Forschungsgruppen, was zur Standardisierung führt. Im Gegensatz zu mikrofluidischen Prototypen sorgt die 384-Well-Plattenschnittstelle zu der Kompatibilität mit den aktuellen Laborgeräten (z. B. Aspiratoren, Plattenhandler und Mehrkanalpipetten) und erleichtert die Integration in die aktuelle Siebinfrastruktur. .
Es gibt mehrere kritische Schritte bei der Durchführung dieses Testes. Das Kollagen-1-Gel sollte den Gelkanal vollständig füllen. Während der Gelbeladung kann diese Füllung beobachtet werden, indem die mikrofluidischen Kanäle entweder durch das Beobachtungsfenster (Abbildung 2a) oder durch Umdrehen der Platte auf den Kopf (siehe Abbildung 1a) untersucht werden. Während der Füllung sollte das Kollagengel im Mittelkanal bleiben, ohne in benachbarte Perfusionskanäle zu fließen. Wir stellten fest, dass die Qualität des Kollagen-1-Gels entscheidend für die richtige Assay-Performance ist. Kollagen-1-Chargen mit zu hoher Viskosität führen zu einer unvollständigen Füllung des Gelkanals. Nach 10 min Polymerisation bei 37 °C sollte das Gel homogen und klar sein. Wenn Kollagen-1 nicht richtig gelagert wird (z.B. aufgrund schwankender Temperaturen im Kühlschrank), polymerisiert kollagen innerhalb der Kanäle mit deutlich sichtbarer Faserbildung. Dies kann zu einer Invasion der ECs in das Gel ohne Zugabe von angiogenen Faktoren, aber ohne angemessene Lumenentwicklung führen.
Wenn die Zellen gesät sind, wird die Fibronectin-Beschichtungslösung aus den Brunnen entfernt, so dass nur die mikrofluidischen Kanäle mit Beschichtungslösung gefüllt werden. Die Aspiration der Beschichtungslösung aus mikrofluidischen Kanälen kann zu Gelstörungen oder Gelabsaugung führen. Die Zellsuspension muss diese Beschichtungslösung ersetzen/verdrängen. Dies funktioniert am besten, wenn die Zellsuspension mit dem passiven Pumpverfahren gesät wird, da das direkte Pipettieren der Zellsuspension in die Kanäle weniger reproduzierbare Sädichten zeigt.
Da die Mikrogefäße eine stabile Monoschicht gegen das Gel bilden, führen diese kleinen Unterschiede nur zu unterschiedlichen Zeiten, die für das Erreichen der Konfluenz erforderlich sind. So wird der Assay-Startpunkt durch Diekonfluenz und nicht durch Kulturzeit bestimmt. Bei Bedarf kann die Kultivierungszeit verlängert werden, bis eine klare Monoschicht gegen das Gel gebildet wurde.
Innerhalb der Brunnen können Luftblasen durch falsche Befüllung der Brunnen eingefangen werden (siehe Abbildung 2b). Diese Luftblasen schränken den Fluss des Mediums ein, selbst wenn das Gerät auf einer Wippplattform platziert wird, und führen zum Zusammenbruch des Mikrogefäßes und zu einer unsachgemäßen Gradientenbildung. Das Drücken der Pipettenspitze gegen die Seitenwand der Brunnen erhöht den Erfolg, den Brunnen vollständig zu füllen. Wenn eine Luftblase in den Brunnen gefangen ist, kann sie durch sanftes Einsetzen einer sterilen Pipettenspitze in den Glasboden entfernt werden. Luftblasen können auch innerhalb der mikrofluidischen Kanäle auftreten. Wenn Medium aus den Brunnen entfernt wurde, ist die Verdunstung des Mediums aus den mikrofluidischen Kanälen nach 30 min (aufgrund der Mikrolitervolumina innerhalb der Kanäle) spürbar. So werden mittlere Veränderungen vorzugsweise so schnell wie möglich durchgeführt. Wenn Medium in einem Kanal mit verdampftem Medium hinzugefügt wird, werden Luftblasen in den mikrofluidischen Kanälen eingeschlossen. Diese Luftblasen innerhalb der mikrofluidischen Kanäle können manuell entfernt werden, indem eine P20 Pipette direkt auf den Ein- oder Auslass platziert wird und das Medium durch die Mikrofluidik aus dem gegenüberliegenden Brunnen gezwungen wird. Die erfolgreiche Entfernung der Luftblasen führt zu einer kleinen, aber spürbaren Volumenabnahme im anderen Brunnen. In Tabelle 1 sind häufige Fehler aufgeführt und wie Sie diese beheben können.
Das Fehlen einer Pumpe ist eine Einschränkung, wenn eine kontinuierliche Bildgebung erforderlich ist, da die Rockerplattform den Benutzer in sequenziellen Zeitintervallen auf das Bild beschränkt. Darüber hinaus besteht die Durchblutung des Mediums in dieser Plattform aus bidirektionalen Strömungen mit geringer Scherspannung, während die Vaskulatur in vivo einem unidirektionalen Fluss mit höherer Scherspannung ausgesetzt ist. Während wir keine negativen Auswirkungen des bidirektionalen Flusses in Bezug auf die angiogene Keimung beobachten, ist der Fluss ein wichtiger biomechanischer Stimulus und vorzugsweise kontrolliert. Obwohl es handelsübliche Pumpen-Setups gibt, bleibt die Anbindung an die 384-Well-Platte eine Herausforderung und Pumpen-Setups behindern die Skalierbarkeit dieses Assays erheblich.
Die Möglichkeit, iPSC-ECs zur Untersuchung von angiogenen Keimungen zu verwenden, eröffnet neue Möglichkeiten in der Krankheitsmodellierung und Arzneimittelforschung. Im Gegensatz zu primären ECs können diese Zellen in nahezu unbegrenzten Mengen mit einem stabilen Genotyp erzeugt werden, und durch die Verwendung von Genom-Editing-Techniken können Zellen erzeugt werden, die GenKnockouts und Knock-Ins einschließen. Da die Protokolle zur Unterscheidung von ECs von iPSC jedoch relativ neu sind, ist noch unklar, was zu iPSC-ECs führt, die primär eCs am besten widerspiegeln, und welche Subtypen von EC erzeugt werden können oder werden können. Auch gibt es noch Fragen in Bezug auf ihre Relevanz. Zeigen iPSC-ECs beispielsweise noch die Plastizität, die typisch für Endothelzellen ist? Und inwieweit reagieren und interagieren iPSC-abgeleitete Zellen auf ihre zelluläre Mikroumgebung? Die hier vorgestellte standardisierte Plattform könnte genutzt werden, um einige dieser Fragen zu beantworten, um die Verwendung von iPSC-abgeleiteten ECs in vitro weiter zu validieren.
Die geradlinigste zukünftige Richtung für diesen Test wird die Integration anderer Zelltypen sein, die eine wichtige Rolle während der Angiogenese spielen, wie Pericyten und Makrophagen. Dies wird die Fähigkeit erleichtern, die Rolle von Makrophagen während der Anastomose zwischen Sprossen oder die Einhaltung von Pericyten nach der Kapillarbildung zu untersuchen. Es ist auch möglich, verschiedene andere Zelltypen innerhalb oder gegen eine extrazelluläre Matrix zu kultiieren (z.B. haben wir die Kultur von Neuronen und verschiedenen epithelialer Strukturen wie proximalen Tubuli und Dünndarmen gezeigt), die mit dem Vaskulären kombiniert werden können Betten, die mit dieser Methode generiert werden. Schließlich wird es interessant sein, angiogene Keimung in synthetischen Hydrogelen zu untersuchen, da ihre definierte Zusammensetzung die Standardisierung des Assays weiter erhöht und die Abstimmung von Steifigkeits- und Bindungsmotiven ermöglicht, die Zell-Matrix-Wechselwirkungen beeinflussen.
Zusammenfassend zeigt diese Methode die Machbarkeit von iPSC-abgeleiteten ECs in einem standardisierten und skalierbaren 3D-Angiogen-Assay, der physiologisch relevante Kulturbedingungen in einer Plattform kombiniert, die die erforderliche Robustheit und Skalierbarkeit hat, die in Drogen-Screening-Infrastruktur.
