Elektrophysiologische Aufnahmen von einzelzelligen Ionenströmen unter genau definiertem Scherspannung

Summary

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine modifizierte parallele Plattendurchflusskammer für die Untersuchung der Echtzeitaktivierung von mechanosensitiven Ionenkanälen durch Scherspannung zu beschreiben.

Abstract

Flüssigkeitsscherspannung ist bekannt, eine wichtige Rolle in der endothelialen Funktion zu spielen. In den meisten Gefäßbetten löst ein erhöhter Scherstress durch akute Nukzesserhöhungen eine Signalkaskade aus, was zu vasodilatation führt und dadurch die mechanische Belastung der Gefäßwand lindert. Das Muster der Scherspannung ist auch bekannt als ein kritischer Faktor bei der Entwicklung von Arteriosklerose mit laminaren Scherstress atheroprotective und gestörtscher Stress pro-atherogen. Während wir ein detailliertes Verständnis der verschiedenen Zwischenzellsignalwege haben, werden die Rezeptoren, die zuerst den mechanischen Stimulus in chemische Mediatoren übersetzen, nicht vollständig verstanden. Mechanosensitive Ionenkanäle sind entscheidend für die Reaktion auf die Scherung und regulieren die scherinduzierte Zellsignalisierung und steuern so die Produktion von vasoaktiven Mediatoren. Diese Kanäle gehören zu den frühesten aktivierten Signalkomponenten zum Scheren und wurden durch Förderung der Stickstoffmonoxidproduktion mit der scherinduzierten Vasodilatation in Verbindung gebracht (z.B. nach innen korrigierende K⁺ [Kir] und transientes Rezeptorpotential [TRP] Kanäle) und Endothel-Hyperpolarisierungsfaktor (z. B. Kir- und Calcium-aktivierte K⁺ [KCa]-Kanäle) und scherinduzierte Vasokonstriktion durch einen unbestimmten Mechanismus, der Piezokanäle umfasst. Das Verständnis des biophysikalischen Mechanismus, durch den diese Kanäle durch Scherkräfte (d. h. direkt oder durch einen primären Mechano-Rezeptor) aktiviert werden, könnte potenzielle neue Ziele zur Lösung der pathophysiologie im Zusammenhang mit endotheliaaler Dysfunktion bieten. und Atherogenese. Es ist immer noch eine große Herausforderung, die strömungsinduzierte Aktivierung von Ionenkanälen in Echtzeit mittels Elektrophysiologie aufzuzeichnen. Die Standardmethoden zur Belichtung von Zellen gegenüber klar definierter Scherspannung, wie dem Kegel- und Plattenrheometer und der geschlossenen parallelen Plattendurchflusskammer, erlauben keine Echtzeituntersuchung der Ionenkanalaktivierung. Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine modifizierte parallele Plattendurchflusskammer zu beschreiben, die eine elektrophysiologische Echtzeitaufzeichnung mechanosensitiver Ionenkanäle unter genau definierter Scherspannung ermöglicht.

Introduction

Hämodynamische Kräfte, die durch den Blutfluss erzeugt werden, sind dafür bekannt, eine wichtige Rolle in der endothelialen und vaskulären Funktion^1,2zu spielen. Es ist auch bekannt, dass mehrere Arten von Ionenkanälen akut auf Veränderungen der Scherspannung^3,4,5 reagieren, was zu der Hypothese führt, dass Ionenkanäle primäre Scherspannungssensoren sein können. In jüngerer Zeit haben wir und andere gezeigt, dass mechanosensitive Ionenkanäle in mehreren scher-stressempfindlichen Gefäßfunktionen eine entscheidende Roll....

Protocol

Die Verwendung von Tieren in unseren Studien ist von der University of Illinois at Chicago Animal Care Committee (#16-183) zugelassen.

1. Montage der modifizierten Parallelplattendurchflusskammer

HINWEIS: Siehe Tabelle 1 und Abbildung 1 für MPP-Flusskammerstück-IDs. In Abbildung 1 finden Sie einen Schaltplan, in dem die Ausrichtung von Kammerstücken für die Montage detailliert beschrieben wird.

1. Um das rechteckige Abdeckglas, Stück D, an der Unterseite des Stücks C zu befestigen, stellen Sie zunächst die Silikon....

Results

In Abbildung 1sind mehrere Fotografien mit unterschiedlichen Ansichten der MPP-Flusskammer auf der Mikroskopbühne (oberes Panel) und einer schematischen Darstellung der MPP-Durchflusskammer (untere Wandgruppe) dargestellt. Der Schaltplan beschreibt die Abmessungen des gesamten Gerätes und der Durchflusskammer. Abbildung 2 zeigt ein Foto des Schwerkraftperfusionssystems zur MPP-Durchflusskammer in unserem Labor (Obere Platte). Gez.......

Discussion

Das Gefäßsystem ist ständig aktiven hämodynamischen Kräften ausgesetzt, die mechanosensitive Ionenkanäle^3,22 aktivieren, aber die physiologischen Rollen dieser Kanäle in der Scherstress-induzierten Mechanotransduktion sind nur 4,^6,8. Die Mechanismen, die für die Mechanosensitivität von scherenspannungsaktivierten Kanälen verantwortlich sind, bleiben unbekannt. Das hier b.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,2 &Mikro; m sterile Spritzenvorsatzfilter	VWR	28145-501	Wird zum Filtrieren von elektrophysiologischer Pipettenlösung
5-Grad-Pinzetten verwendet	Feine wissenschaftliche Werkzeuge	1252-30	Wird zum Übertragen von verdauten Arterien in eine frische Lösung
verwendet 9" Pasteur Pipet	Fisher Scientifc	13-678-20D	Wird zum mechanischen Aufbrechen verdauter Arterien und zum Übertragen frisch isolierter endohtelialer Zellen verwendet
Deckglaskreise mit einem Durchmesser von 12 mm	Fisher Scientifc	12-545-80	Zur Verwendung bei Studien mit kultivierten Zellen und mehreren Behandlungen. Die auf das Deckglas geklebten Zellen werden für Patch-Clamp-Analysen verwendet
24 mm x 40 mm Rectangluar Deckglas	Sigma-Aldrich	CLS2975224	Deckglas zum Hinzufügen zu MPP-Durchflusskammerstücken C (Abbildung 1)
24 mm x 50 mm Rechteckiges Deckglas	Sigma-Aldrich	CLS2975245	Deckglas zum Hinzufügen zum MPP-Durchflussraum E (Abbildung 1)
20 G Spritzennadeln	Becton Dickinson und Co	305175	Zur Verwendung bei der mechanischen Disruption von verdauten Mesenterialarterien
35 mm Petrischale	Genesee Scientific	32-103	Zur Verwendung bei der mechanischen Disruption von verdauten Mesenterialarterien
Amphotericin B solubilisiert	Sigma-Aldrich	A9528-50MG	Wird zur Erzeugung der perforierten Ganzzell-Patch-Konfiguration verwendet.
Kollagenase, Typ I	Worthington Biochemical	100 mg - LS004194	Enzym, das in unserem Labor als kurzer Aufschluss nach dem ersten Cocktail aus neutraler Protease und Elastase verwendet
wird Dimethylsulfoxid (DMSO)	Fisher Scientifc	67-68-5	Lösungsmittel für Amphotericin B, das in perforierten Ganzzell-Patch-Clamps verwendet
wird Elastase, lyophilisiert	Worthington Biochemical	25 mg - LS002290	Enzym, das in unserem Labor in einem Cocktail mit neutraler Protease/Dispase verwendet wird, um die Verdauung der Arterien für die Isolierung von Endothelzellen zu beginnen.
Falcon Gewebekulturplatte, 6-Well, flacher Boden mit Deckel mit geringer Verdunstung	Corning	353046	Zur Verwendung mit Studien mit kultivierten Zellen und mehreren Behandlungen
Neutrale Protease/Dispase	Worthington Biochemical	10 mg- LS02100 50 mg - LS02104	Enzym, das in unserem Labor in einem Cocktail mit Elastase verwendet wird, um die Verdauung von Arterien für die Isolierung von Endothelzellen zu beginnen
SylGard	World Precision Instruments	SYLG184	Silikonelastomer zum Verkleben des rechteckigen Deckglases mit den MPP-Durchflusskammerstücken C und E (Abbildung 1)
Tygon ND 10-80 Schlauch	Microbore Schlauch	AAQ04133	ID: 0,05 Zoll, Außendurchmesser: 0,09 Zoll, Einlassperfusionsschlauch zur Verwaltung des Durchflusses zur Kammer