Panmyeloische Differenzierung von humanem Cordblood abgeleitet CD34+ hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll zur immunphenotypischen Charakterisierung und Zytokin-induzierten Differenzierung von Nabelschnurblut abgeleitet CD34⁺ hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen zu den vier myeloischen Linien vor. Die Anwendungen dieses Protokolls umfassen Untersuchungen über die Wirkung von myeloischen Krankheitsmutationen oder kleinen Molekülen auf die myeloische Differenzierung der CD34⁺ Zellen.

Abstract

Die Ex-vivo-Differenzierung menschlicher hämatopoetischer Stammzellen ist ein weit verbreitetes Modell zur Untersuchung der Hämatopoese. Das hier beschriebene Protokoll ist für die zytokininduzierte Differenzierung von CD34⁺ hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen zu den vier myeloischen Abstammungszellen. CD34⁺ Zellen werden aus menschlichem Nabelschnurblut isoliert und in Gegenwart von Zytokinen mit MS-5 Stromalzellen kokultiviert. Die immunotypische Charakterisierung der Stamm- und Vorläuferzellen sowie der differenzierten myeloischen Abstammungszellen werden beschrieben. Mit diesem Protokoll können CD34⁺ Zellen mit kleinen Molekülen inkubiert oder mit Lentiviren transduziert werden, um myeloische Krankheitsmutationen auszudrücken, um ihre Auswirkungen auf die myeloische Differenzierung zu untersuchen.

Introduction

Die normale Differenzierung hämatopoetischer Stammzellen (HSCs) ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der physiologischen Werte aller Blutkörperchen. Während der Differenzierung, in einer koordinierten Reaktion auf extrazelluläre Hinweise einschließlich Wachstumsfaktoren und Zytokine, HSCs zuerst entstehen multipotente Vorläuferzellen (MPP) Zellen, die lympho-myeloides Potenzial^{haben 1,2,3 ,4} (Abbildung 1). MPPs führen zu gemeinsamen myeloischen Vorläufern (CMPs) und gemeinsamen lymphoiden Vorläufern (CLPs....

Protocol

Menschliches Nabelschnurblut zum Experimentieren wurde von gesunden Personen nach informierter Zustimmung zu Maricopa Integrated Health Systems (MIHS), Phoenix gespendet. Die identifizierten Einheiten wurden durch eine Materialtransfer-Vereinbarung zwischen MIHS und der University of Arizona erhalten.

1. Reagenzien und Puffer

HINWEIS: Bereiten Sie alle Reagenzien und Puffer unter sterilen Bedingungen in einem biologischen Sicherheitsschrank vor.

1. Bereiten Sie sterilen PBS-BSA-EDTA (PBE) Puffer vor, indem Sie 7,2 ml steriles 35% Rinderserumalbumin (BSA; sterile Gewebekultur grade 35% BSA)....

Results

Die Anwendung der oben genannten Protokolle ergibt 5,6 (ca. 0,5) x 10⁸ MNCs und 1 (ca. 0,3) x 10⁶ CD34⁺ Zellen aus einer Nabelschnurbluteinheit von 100 ml. Der Prozentsatz der gesamten CD34⁺ Zellen liegt zwischen 80-90% (Abbildung 2A,B). Die immunotypische Analyse nach dem von Manz et al.⁵ beschriebenen Schema zeigt, dass die CD34⁺ Zellen in der Regel aus 20 % HSCs und 72 % MPPs bestehen, die Lin<.......

Discussion

Das hier beschriebene Protokoll eignet sich zur ex vivo-Differenzierung von UCB-abgeleiteten CD34⁺ HSPCs zu den vier myeloischen Linien. Die anfängliche Inkubation mit einem Zytokin-Mix bestehend aus SCF, TPO, Flt3L und IL3 stimuliert die CD34⁺ Zellen. Anschließend wird die Differenzierung mit einem Cocktail aus SCF, IL3, Flt3L, EPO und TPO erreicht. In diesem Mix sind SCF, IL3 und Flt3L wichtig für das Überleben und die Proliferation von CD34⁺ HSCs. EPO und TPO fördern die Differenzierun.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,4 % Trypanblau-Lösung	Thermo Fisher Scientific	15250-061	Verdünnen Sie das Arbeitsmaterial auf 0,2 % in sterilem 1x PBS
0,5 M Ultrareines Ethylendiamin-Tetraessigsäure, pH 8,0	Gibco	15575-038
10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Invitrogen	14185052	1x mit sterilem destilliertem Wasser & pH auf 7,2 verdünnen
2,5% Trypsin, kein Phenolrot	Thermo Fisher Scientific	15090046	Arbeitsmaterial auf 1x verdünnen mit sterilem 1x PBS
30 & Mikro; m Vorabscheidungsfilter	Miltenyi biotech	130-041-407
35 % steriles Rinderserumalbumin	Sigma-Aldrich	A7979
7-AAD	Biolegend	420404	Wird als Lebend-/Totfärbung verwendet, um abgestorbene Zellen aus der FACS-Analyse zu eliminieren
Anti-humaner CD10-FITC-Antikörper (Klon HI10a)	Biolegend	312207	Verwendung einer Verdünnung
von 1:20Anti-humaner CD11b-FITC-Antikörper (aktiviert) (Klon CBRM1/5)	Biolegend	301403	Use 1:5 Verdünnung
Anti-humaner CD123-APC-Antikörper (Klon 6H6)	Biolegend	306012	Use 1:20 Verdünnung
Anti-humaner CD14-PE-Antikörper (Klon M5E2)	Biolegend	301806	Use 1:20 Verdünnung
Anti-humaner CD19-FITC-Antikörper (Klon 4G7)	BD Biosciences	347543	Use 1:5 Verdünnung
Anti-humaner CD235a-APC-Antikörper (Klon GA-R2 (HIR2))	BD Biosciences	551336	Verwendung 1:20 Verdünnung
Anti-humaner CD235a-FITC-Antikörper (Klon HIR2)	Biolegend	306609	Verwendung 1:50 Verdünnung
Anti-humaner CD34-APC-Cy7-Antikörper (Klon 581)	Biolegend	343514	Verwendung 1:20 Verdünnung
Anti-humaner CD38-PE-Antikörper (Klon HIT2)	Biolegend	303506	Verwenden Sie eine Verdünnung von 1:20
Anti-humaner CD3-FITC-Antikörper (Klon UCHT1)	Biolegend	300405	Verwendung 1:20 Verdünnung
Anti-humaner CD41a-PerCP-Cy5.5-Antikörper (Klon HIP8)	Biolegend	303720	Verwendung 1:20 Verdünnung
Anti-humaner CD45Ra-PE-Cy7-Antikörper (Klon HI100)	Biolegend	304126	Verwendung 1:20 Verdünnung
Anti-humaner CD66b-PE-Cy7-Antikörper (Klon G10F5)	Biolegend	305116	Verwendung 1:20 Verdünnung
Anti-humaner CD7-FITC Antikörper (Klon CD7-6B7)	Biolegend	343103	Verwendung 1:20 Verdünnung
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100	Filter vor Gebrauch sterilisieren
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) Pulver mit L-Glutamin	Gibco	12100046	Rekonstituieren Sie 1 Packung zur Herstellung von 1 l DMEM-Medien mit Natriumbicarbonat, 10 % FBS und 1 % Penicillin und Streptomycin.
Fötales Rinderserum, australische Quelle, hitzeinaktiviertes	Omega Scientific	FB-22 Los #609716
Humanes CD34-Mikrokügelchen-Kit	Miltenyi biotech	130-046-702
Humanes Thrombopoietin (TPO), Forschungsqualität	Miltenyi biotech	130-094-011	Machen Sie einen Vorrat von 100 µ g/ml in 1x PBS + 0,1% BSA. Verwenden Sie 50 ng/ml sowohl für die myeloische Differenzierung als auch für die Stimulationsmedium
L-Glutamin	Omega Scientific	GS-60	2 mM Konzentration im Stimulationsmedium
LS Säulen	Miltenyi biotech	130-042-401
MACS Multiständer	Miltenyi biotech	130-042-303
MidiMACS Magnetseparator	Miltenyi biotech	130-042-302
MNC Fraktionierungsmedien (Ficol-Paque PLUS)	GE Healthcare Biosciences	17-1440-03
MS-5 Zellen			Geschenk aus dem Labor von Gay Crooks, UCLA
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148	800 mL 1x PBS in einem Becherglas auf einer Rührplatte in einer chemischen Haube auf ~65 & C erhitzen. 10 g Paraformaldehydpulver hinzufügen. Um das Paraformaldehyd vollständig aufzulösen, erhöhen Sie den pH-Wert durch Zugabe von 1 N NaOH. Die Lösung abkühlen und filtrieren und das Volumen mit 1x PBS auf 1 l auffüllen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2 ein.
Penicillin & Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458-100ml
Poly-L Lysin	Sigma-Aldrich	P2636	Stellen Sie eine 10 mg/ml Brühe in 1x PBS
Rekombinantes humanes Erythropoietin-alpha (rHu EPO-α)	BioBasic	RC213-15	Machen Sie einen Bestand von 2.000 Einheiten/ml in 1x PBS + 0,1% BSA. Verwenden Sie 4 Einheiten/ml für die myeloische Differenzierung
Rekombinantes humanes Fibronektin-Fragment (RetroNectin)	Takara	T100B	Use 20 & Micro; g/ml, verdünnt in sterilem 1x PBS, um die Vertiefungen vor der Stimulation von CD34+ HSCs zu beschichten.
Rekombinanter humaner Flt-3-Ligand (rHu Flt-3L)	BioBasic	RC214-16	Machen Sie einen Vorrat von 100 & Mikro; g/ml in 1x PBS + 0,1% BSA. Verwenden Sie 5 ng/ml für die myeloische Differenzierung & 50 ng/mL im Stimulationsmedium
Rekombinantes humanes Interleukin-3 (rHu IL-3)	BioBasic	RC212-14	Machen Sie einen Vorrat von 100 & Mikro; g/ml in 1x PBS + 0,1% BSA. Verwenden Sie 5 ng/ml für die myeloische Differenzierung & 20 ng/mL im Stimulationsmedium
Rekombinanter humaner Stammzellfaktor (rHu SCF)	BioBasic	RC213-12	Machen Sie einen Vorrat von 100 &; Mikro; g/ml in 1x PBS + 0,1% BSA. Verwenden Sie 5 ng/ml für die myeloische Differenzierung & 50 ng/mL im Stimulationsmedium
Serum freies Medium (X-Vivo-15)	Lonza	04-418Q
Natriumbicarbonat	Fisher Scientific	BP328-500
Wright-Giemsa Färbung, modifiziert	Sigma-Aldrich	WG16-500	Gemäß den Anweisungen des Herstellers verwenden
Ausrüstung
BD LSR II Durchflusszytometer	BD Biosciences
Zentrifuge	Sorvall Legend RT
Lichtmikroskop	Olympus